細胞的生物學特性范文

導語：如何才能寫好一篇細胞的生物學特性，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公文云整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

Biological characteristics of placentaderived adherent cells

【Abstract】 AIM: To isolate and culture human placentaderived adherent cells (hPDAC) in vitro and study their biological characteristics involving morphology， phenotype and differentiation. METHODS: Mononuclear cells were harvested after placenta tissue was digested by collagenase IV， seeded and cultured in lowglucose DMEM containing 100 mL/L FBS. Their surface markers were detected by flow cytometry; the growth curve was made; cells of 3 passages were induced to differentiate into osteoblasts with vitamin C， dexamethasone and sodium βglycerophosphate， and the induced cells were observed in the change of matrix mineralization with alizarin red staining; cells of 3 passages were induced to differentiate into lipocytes with dexamethasone and insulin， and the induced cells were observed with oil red O staining. RESULTS: By day 7-14， a few of adherent cells were observed and expanded the same as fibroblasts， and adherent cells were positive for CD29， CD44 and CD105， but negative for CD34， CD45， CD19. After 10day induction， alizarin red staining showed the calcium mineralization and after 7 d， oil red O staining revealed the appearance of fat drops. CONCLUSION: The hPDAC was confirmed to have the osteogenic and adipogenic potentials， indicating that they could be regarded as an alternative source of stem cells.

【Keywords】 placenta; adherent cells; stem cells

【摘要】 目的： 通過體外分離和培養胎盤貼壁細胞，以研究其形態、表型和分化特點. 方法： 采用IV型膠原酶消化人胎盤組織，獲得單個核細胞，接種于100 mL/L FBS 低糖DMEM培養基中，貼壁后常規換液、傳代，流式細胞儀檢測其表面標志，繪制生長曲線. 采用β甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松聯合誘導，使胎盤貼壁細胞分化為成骨細胞，誘導后10 d行茜素紅染色；采用地塞米松、胰島素誘導，使胎盤貼壁細胞分化為脂肪細胞，油紅O染色鑒定. 結果： 培養7~14 d后有少量貼壁細胞生長，逐漸呈成纖維細胞狀，表達CD29，CD44和CD105，不表達CD34，CD45，CD19；在成骨誘導10 d后細胞茜素紅染色可見鈣鹽沉積，成脂肪誘導7 d后油紅O染色見脂肪滴形成. 結論： 通過不同方式誘導培養，胎盤貼壁細胞可分化為成骨細胞及脂肪細胞，提示胎盤貼壁細胞可能是新的干細胞來源.

【關鍵詞】 胎盤；貼壁細胞；干細胞

0引言

間充質干細胞（marrow stromal cell， MSC）主要來源于骨髓，可以分化為多種組織細胞：成骨、軟骨、脂肪、神經細胞等，但隨著年齡增長或合并感染、腫瘤等疾病時骨髓干細胞的分化能力明顯下降，因此尋找新的干細胞成為當務之急. 近幾年來有學者發現胎盤組織中存在MSC. 為進一步證實這一發現，我們從胎盤中提取貼壁細胞，觀察其生物學特性，以探討其是否具有干細胞特性.

1材料和方法

1.1材料足月剖宮產的胎盤（產婦同意），低糖DMEM（Gibco公司），新生牛血清（FBS，Gibco公司），IV型膠原酶（Sigma公司），胰蛋白酶（Sigma公司），鼠抗人單克隆抗體CD19，CD44，CD45，CD105，CD34，CD29（晶美公司），茜素紅（Sigma），油紅O（Sigma），倒置顯微鏡（Olympas），CO2培養箱（Jouan）.

1.2方法

1.2.1胎盤貼壁細胞的分離和培養取足月剖宮產胎盤，剪取胎兒側胎盤組織，PBS反復沖洗，剪成碎塊，以1 g/L IV型膠原酶37℃消化30 min，取上清液，以800 r/min離心5 min，沉淀物重復消化，收集每次離心后的細胞沉淀，PBS沖洗2遍，以1×107/L的密度接種于100 mL/L FBS DMEM培養基中，貼壁后3~5 d換液1次，取傳3代以上細胞備用.

1.2.2胎盤貼壁細胞的表型測定取第3代細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，100 mL/L FBS終止消化，PBS沖洗2遍，調整細胞數為1×104/μL，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD19， CD44， CD45， CD105， CD34，流式細胞儀檢測細胞表型.

1.2.3生長曲線的繪制取第3代細胞，以2×107/L的密度接種于12孔板中，每日取3復孔，臺盼藍染色計數活細胞，連續培養計數7 d，計算平均值，繪制生長曲線.

1.2.4細胞周期測定取第3代細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，10 mol/L FBS終止消化，PBS沖洗2遍，調整細胞數為1×106/L，流式細胞儀檢測細胞周期.

1.2.5細胞誘導分化及染色取第3代胎盤細胞，以2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min， 10 mol/L FBS終止消化，800 r/min離心5 min，PBS沖洗3遍，分為4組分別以1×105/L細胞數接種于6孔板中，1組加入成骨誘導劑（20 mmol/L β甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C，10 mmol/L地塞米松，100 mL/L新生牛血清DMEM培養基），2組加入脂肪誘導劑（10 mmol/L地塞米松、10 mg/L胰島素、100 mL/L新生牛血清DMEM培養基），3，4組為對照組，采用100 mL/L新生牛血清DMEM培養基培養，置37℃，50 mL/L CO2孵箱培養，每3~5日換液1次. 取培養10 d后的1，3組細胞，倒掉培養液，多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3遍，茜素紅染色8 h，顯微鏡下觀察陽性結果. 取培養7 d后的2，4組細胞，多聚甲醛固定后油紅O染色.

2結果

2.1胎盤細胞的原代培養消化胎盤組織獲得少量的單個核細胞，約7~14 d后貼壁，從不規則形，逐漸變為梭形，呈漩渦狀生長，約4 wk后長滿瓶底，胞體呈細長，形態類似成纖維細胞（圖2），1 wk左右傳代1次，可穩定傳至10代. 流式細胞儀檢測顯示低表達CD29，高表達CD44和CD105，不表達CD34，CD45和CD19. 細胞的對數生長期約在第2~4日，其倍增時間為39 h（圖1）. 流式細胞儀檢測發現G0/G1，S，G2/M期的比例分別為20.15%， 72.54%和6.89%.

圖1胎盤貼壁細胞生長曲線（略）

2.2胎盤細胞的誘導分化成骨誘導組細胞在誘導10 d時可見細胞呈漩渦狀重疊生長，并聚集成團，茜素紅染色可見多個散在分布大小、形態各異的不透明棕紅色鈣化結節. 對照組少見鈣化結節（圖3）. 成脂肪誘導組細胞在誘導7 d時油紅O染色可見細胞中出現多個染色深紅的脂肪滴，而對照組中則偶見脂肪滴（圖4）.

A： 培養10 d；B： 培養28 d.

圖2胎盤原代細胞×100（略）

A：誘導組; B：對照組.

圖3成骨細胞茜素紅染色 ×100（略）

A：誘導組；B：對照組.

圖4成脂細胞油紅O染色 ×100（略）

3討論

早在2000年即有學者從凍存的胎盤組織中分離培養出貼壁細胞［1］，但胎盤間充質干細胞（MSC）的研究尚處于起步階段. 我們從形態學、免疫學及分化能力等方面加以研究進一步證實胎盤貼壁細胞的生物學特性. 一般認為大多數MSC培養時貼壁，呈成纖維細胞狀，因而采用貼壁法獲得MSC的研究較多［2］. 胎盤是實體組織，富含血管和間充質成分，我們采用酶消化法，獲取細胞沉淀進行培養，與骨髓貼壁細胞相比較，其貼壁時間較長（1~2 wk），骨髓為72 h［3］，并且胎盤貼壁細胞需28 d左右才能鋪滿瓶底. 骨髓貼壁細胞大多最初為梭形，7 d左右形成小集落，其后迅速生長，變為均一的長梭形［3］，與胎盤貼壁細胞相似. 另外我們的實驗檢測到的胎盤貼壁細胞的倍增時間為39 h，文獻中為37 h［4］；我們檢測細胞周期顯示細胞大部分處于分裂期，而以往的報道發現細胞大部分處于靜息期［4］，因而胎盤貼壁細胞的特性尚需進一步研究.

目前對于胎盤貼壁細胞的免疫學特點尚無統一的認識，我們的研究發現胎盤貼壁細胞的表型與骨髓MSC相似［5-6］，表達CD29， CD44和CD105，不表達CD34， CD45， CD19， CD44， CD29均為黏附分子，是纖連蛋白和透明質酸鹽的受體，在基質細胞中表達較多，這樣的結果使我們推測培養的胎盤貼壁細胞中可能包含大量的能表達基質細胞標志的細胞，即MSC，但僅憑細胞形態和少量的表面標志尚不能完全說明貼壁細胞即為MSC，MSC的最重要特性應該是多向分化潛能.

如果胎盤貼壁細胞中含有MSC，理論上講MSC來源于中胚層，具有向中胚層組織及神經外胚層組織分化的能力［7-8］. 我們的實驗證明β甘油磷酸鈉和低濃度的地塞米松聯合誘導后細胞中鈣鹽沉積，茜素紅染色顯示產生大量鈣化結節，說明其有成骨能力，只有干細胞才具有這種能力. 在誘導體系中維生素C可以促進體外培養細胞合成膠原，形成鈣化，能調節ATP及ALP活性，并影響其合成，β甘油磷酸鈉可以提供磷離子作為ALP的底物，地塞米松可以增強ALP活性. 而ALP可以破壞鈣化抑制劑，啟動鈣化［8］形成鈣鹽，茜素紅特異性結合鈣劑，陽性表現為棕紅色，鈣的含量愈高染色愈深，是鑒定成骨細胞特性的特異性指標.

我們的實驗由于條件限制，只是初步觀察胎盤貼壁細胞的特點，證明其具有干細胞特性，但尚有許多問題如培養的條件、促進生長的因子、傳代后是否逐漸衰老、誘導后移植的效果等等，需更深入的研究. 我們的研究提示胎盤貼壁細胞的分離培養具有潛在的臨床應用價值.

參考文獻

［1］ Jaroscak J， Smith T， Haynesworth S， et al. preliminary characterization of the surface staining of placental derived adherent cells: A potential new source of stroma for umbilicol cord blood (UCB)expansion［C］. Am Soc Hematol， 2000:1-5.

［2］ 薜群，苗宗寧，曲靜，等. 胎盤間充質干細胞向神經細胞誘導的實驗研究［J］. 江蘇醫藥雜志，2004，30（11）:817-819.

［3］ 康非吾， 吳正華. 人骨髓間充質干細胞的分離培養及向成骨細胞定向分化的實驗研究［J］. 口腔頜面外科雜志， 2004，12(4):307-310.

［4］ 何津，張毅，江小霞，等. 人胎盤貼壁細胞的分離培養及造血相關因子表達［J］. 中華血液學雜志，2003，24（12）:652-654.

［5］ Guo XM， Wang CY， Wang YH， et al. Experimental study of the isolation， culture and in chondrogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cell［J］. Chin J Stomatol， 2003，38:63-66.

［6］ 張文元，楊亞冬，賀晨， 等. 骨髓間充質干細胞分離培養及向成骨細胞表型的誘導分化［J］. 浙江實用醫學， 2004，9(6):393-395.

［7］ Dorudi S ，kinrode E， Marshall NC， et al . Genetic detection of lymph node micrometastases in patients with colorectal cancer［J］. Br J Surg， 1998，85(1):98.

篇2

[關鍵詞] CIK細胞;擴增;殺傷活性

[中圖分類號] R392.12 [文獻標識碼] A [文章編號]1673-7210（2007）12（c）-019-03

The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells

WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru

(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)

[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P

[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer，CIK)是將人外周血單個核細胞(PBMC)在體外經過多種細胞因子作用后培養獲得的一群異質細胞。它同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點，被認為是增殖速度最快，殺瘤活性最強，殺瘤譜最廣的效應細胞。過繼性免疫治療是治療惡性腫瘤的一個重要輔助治療方法，用于過繼性免疫治療的免疫活性細胞必須具有較強的擴增力和殺傷性。本實驗通過對CIK細胞的體外培養及其生物學特性的研究，以尋求用于過繼免疫治療的高效免疫活性細胞。

1 材料與方法

1.1實驗材料

人外周血樣品取自中心血站12例健康成人自愿者的靜脈血50 ml。男6名，女6名，年齡20～50歲。人肺腺癌細胞株A-549購自南京凱基生物科技發展公司。

1.2主要試劑和儀器

RPMI1640培養基(美國GIBCO公司)；特級無支原體無熱源胎牛血清(美國TBD公司)；人淋巴細胞分離液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技術發展中心，天津)；二巰基乙醇(美國TBD公司)；臺盼藍（美國Sigma公司）；二甲亞砜（美國Sigma公司）；青霉素，鏈霉素（華北制藥有限公司）；胰蛋白酶（南京凱基生物科技發展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等購自北京化學試劑公司；MTT試劑盒（南京凱基生物科技發展公司）；重組人白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美國Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（異硫氰酸熒光素）、CD4-PE（藻紅阮熒光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG熒光抗體（美國eBioscienc公司）；流式細胞儀(美國BD公司)；550酶標儀（美國Biorad公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 PBMC的分離(密度梯度離心法)及LAK、CIK細胞的誘導將人外周抗凝血用淋巴細胞分離，吸取白膜層細胞即PBMC，PBS洗滌3遍，加入含10%無熱源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸鈉、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巰基乙醇、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素培養基），調整細胞濃度，接種于25 cm2培養瓶中，1.0×107個/（10 ml?瓶)，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱內靜置2 h，可見分為黏附于瓶壁的細胞和非黏附細胞。取非黏附細胞分成2組。LAK組:加入500 U/ml IL-2，每3天換液1次并補加500 U/ml IL-2。CIK組:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d換液1次，并補加IL-2及CD3mAb。

1.3.2LAK、CIK細胞表型的檢測在培養1，4，7，10，13，16，19，22 d取培養的細胞，用PBS洗滌兩遍，調整細胞濃度為5.0×106個/ml，取100 μl懸液加入流式專用試管中，加入FITC、PE標記的鼠抗人單克隆抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，對照為IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗滌3遍，洗去多余的抗體。并用同型無關陰性抗體做對照，在流式細胞儀（美國BD公司）上檢測分析，至少分析1.0×105個細胞。

1.3.3 LAK、CIK細胞殺傷活性的檢測取對數生長期的肺癌細胞A-549作為靶細胞，用RPMI1640培養基稀釋成1.0×105個/（100 μl?孔），接種細胞于96孔培養板中，然后取出培養兩組效應細胞，把效應細胞加入靶細胞孔中混合，另設單獨靶細胞和效應細胞組，每組設3個復孔，放置培養箱中培養24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)測儀于570 nm處測OD值，按下面公式計算各組LAK的殺傷活性。

1.4統計學處理

數據采用SPSS12.0統計軟件包處理，數據以均數±標準差（x±s）表示，多個均數間使用單因素方差分析，兩樣本均數的比較用t檢驗，P

2 結果

2.1 CIK細胞的增殖情況

實驗表明PBMC在細胞因子作用下均能增殖，鏡下可見細胞飽滿透亮、聚集成團，呈集落樣生長。與LAK比較，在前期無明顯差異，至19、22 d時擴增能力顯著高于LAK細胞的擴增倍數(P

表1不同培養天數LAK、CIK細胞的增殖情況(x±s，倍)

2.2 CIK細胞的表型分析

用流式細胞儀分析細胞表型，結果顯示CIK細胞培養后，其主要效應細胞CD3+CD56+ 細胞較培養前顯著增加(P

與培養前比較，*P

2.3 CIK細胞的殺瘤活性

CIK細胞在培養至第13天即有較高的殺瘤活性，為61.17%，顯著高于LAK細胞的41.02%(P

與單純的LAK對照組比較，*P

3 討論

近年來惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢，隨著細胞免疫學和分子生物學的發展，細胞免疫治療成為除化療、放療之外的又一重要輔助治療手段，副作用輕微，安全性較好[3]。過繼免疫治療(ALT)是惡性腫瘤生物治療的一個重要手段，是通過直接向腫瘤患者輸注具有抗腫瘤活性的免疫活性細胞，在體內發揮抗腫瘤作用，以此來達到治療腫瘤的目的。淋巴因子誘導的殺傷細胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的殺傷細胞，具有廣譜殺傷腫瘤的細胞活性，其較早用于臨床腫瘤免疫治療并取得了一定療效。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer，CIK)是一種非MHC限制性的高效溶解腫瘤的細胞毒性T細胞，其主要效應細胞表面既有T細胞表面標志CD3，也有NK細胞表面標志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴細胞抗瘤活性和NK細胞非MHC限制性殺瘤的特點。CIK 細胞是一類非主要組織相容性復合物(MHC)和非T細胞受體(TCR)限制性的免疫活性細胞，在培養過程中，一些非活性細胞在多種細胞因子的共同刺激下，激活為有細胞毒作用的CIK 細胞。這些活性細胞發揮抗腫瘤作用的機制很可能是通過黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互結合后，能夠分泌大量的BLT 酯酶的細胞質顆粒，這些顆粒能夠直接穿透封閉的靶細胞膜進行胞吐，從而導致腫瘤細胞的裂解[6]；同時，CIK細胞自身還能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些細胞因子，提高細胞毒作用。是目前最新、殺傷腫瘤效果最佳的生物免疫治療方法。Lanier于1986年首次發現這種異質細胞群(主要是CD3+CD56+細胞)，其在外周血淋巴細胞中的比例為1%～5%[7]。經過多年的實踐，科學家們找到了體外大量擴增CIK細胞的方法，即應用細胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3單抗共同培養產生CIK。我們在實驗中采取此方法，在分離外周血單個核細胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3單抗、IL-1β與IL-2，培養22 d，每3天換液和補加細胞因子，培養13 d時即有25%左右的細胞是CD3+CD56+細胞，具有典型的CIK細胞形態和生物學性狀。CIK具增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、毒副作用小等優點，目前自體及異體外周血CIK細胞已被用于一些實體瘤和惡性血液病的治療，并取得了較好的療效。我們的實驗結果表明，與LAK 細胞相比，CIK細胞具有更強的增殖能力，培養至22 d時體系中總的細胞數可增加100多倍。用流式細胞儀分析細胞表型， 結果顯示CIK細胞培養后， 其主要效應細胞CD3+CD56+ 細胞較培養前顯著增加(P

綜上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3單抗、IL-1β和IL-2等多種細胞因子成功從健康人非貼壁PBMCs中誘導出大量的具有典型形態和免疫表型的CIK細胞，且具有較高的殺傷活性，為下一步臨床治療腫瘤奠定了基礎。

[參考文獻]

[1]Schmidt-Wolf IGH, Negrin RS, kiem HP,et al. Phenotypic characterization and identification of effecter cells involved in tumor cell recognition of cytokine induced killer cells [J].N Engl J Med ,1993,21（12）:1673-1679.

[2]Lu PH, Negrin RS. Anovel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo anti-tumor activity in mice with sever combined immunodeficiency[J]. Immunol,1994,153(6):1687-1696.

[3]Lu PH, Negrin RS. Analysis of cytotoxic activity of the CD4+T lymphocytes generated by local immunotherapy[J]. Cell Immunol，2004,73(1):110-116.

[4]Schmidt-Wolf IGH, Negrin RS. Phenotypic characterization and identification of effecter cells involved in tumor cell recognition of cytokine induced killer cells[J].Exp Hematol,2005,21(6): 623-633.

[5]Lu PH, Negrin RS. Anovel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo anti-tumor activity in mice with sever combined immunodeficiency[J]. Immunol,1994,153:1687-1696.

[6]Siegal FP, Kadowaki N, Shodell M, et al. Interactions between dendritic cells and cytokine-induced killer cellslead to an activation of both populations[J]. Immunother, 2007,24(6):502-510.

[7]Lanier LL, Le Am, Clvin Cl, et al. The relationship of CD16(Leu-11)and Leu-19（KH-1)antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphoc[J]. Immunol, 1986,136（7）:4480-4488.

[8]Katsumoto Y，Monden T，Take da T，et al .Analysis of cytotoxic activity of the CD4+T lymphocytes generated by local immunotherapy[J].Br J Cancer，1996，73(1):110-116.

篇3

【關鍵詞】干細胞； NF-κB抑制因子α；細胞增殖；細胞分化；細胞因子

Effect of mutated IκBα gene on the biological characteristics of immortalized neural progenitor cell strain

ZHU Chang， LIU Zhi-heng， ZHANG Chuan-han， et al. Department of Anesthesiology，Tongji Hospital of Tongji Medical College， Huazhong University of Science & Technology， Wuhan 430030， China

【Abstract】 Objective To observe the effect of mutated IκBα gene on the proliferation，differentiation and cytokine secretion of immortalized neural progenitor cell strain(INPCs). Methods After the establishment of mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs， MTT staining and flow cytometry were used to draw the growth curve and measure the cell proliferation index. Western blot was carried out to observe the differentiation of the two cell strains after 5% blood serum induced differentiation. The expression of TNF-α、IL-1β and IL-6 was measured by realtime RT-PCR. Results It was established by growth curve and cell proliferation index that the proliferation was slowed down in mutated IκBα gene transfected INPCs compared with blank plasmid transfected INPCs. After blood serum induced differentiation，glial fibrillary acidic protein was highly expressed in the two cell strains. There was no difference in the expression of TNF-α between mutated IκBα gene transfected INPCs and blank plasmid transfected INPCs. The expression of IL-1β and IL-6 was reduced in mutated IκBα gene transfected INPCs. Conclusion Mutated IκBα gene can slow down the proliferation of INPCs， reduce the expression of some cytokines， but didn’t influence the differentiation of INPCs.

【Key words】Stem cells；NF-kappaB inhibitor alpha；Cell proliferation ；Cell differentiation； Cytokines

本實驗室成功構建了SV40Tag永生化的大鼠神經前體細胞株（INPCs）[1]，并在此基礎上構建了轉IκBα突變型基因永生化神經前體細胞株。作為細胞移植治療的細胞來源和外源基因的載體，INPCs的生物學特性在轉入外源基因后有何改變，是進一步研究首先應關注的問題。本研究擬通過比較轉IκBα突變型基因及空白對照載體的INPCs在增殖、分化以及細胞因子分泌功能上的差異，為進一步將該轉基因細胞用于細胞移植治療腦缺血等中樞神經系統疾病奠定基礎。

材料與方法

材料 轉染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs由本實驗室構建，DMEM/F12培養基、B27無血清培養添加劑（Gibco公司，美國）；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)（Pepro Tech公司，英國）； MTT、碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國）；抗β-actin抗體、抗膠原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體、抗微管相關蛋白2（MAP2）抗體（Neomarkers公司，美國）； Trizol試劑（上海華舜公司），SYBR ExScriptTM RT-PCR Kit (Takara，日本)。

細胞培養及傳代 轉染pcDNA3.1或pcDNA3.1/IκBαM的INPCs在含2%B27、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、0.3μg/ml嘌呤霉素的DMEM/F12培養基中，置37℃、5%CO2培養箱培養，0.25％胰酶消化傳代。

細胞生長曲線的繪制 將轉染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs以每孔5×103的密度接種于96孔板，共種8板，每板每株細胞接種12孔，每24h取出一板，每孔加入0.2％MTT 50μl，繼續培養4h后，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10 min，在酶標儀（Bio-Rad公司，美國）上測定570nm吸光度值，并繪制生長曲線。

細胞增殖指數的測定 將轉染pcDNA3.1及pcDNA3.1/IκBαM的INPCs分別制成單細胞懸液，PBS 洗一次后，加入-20 ℃預冷的80 %乙醇固定， 冰浴30min，固定后的細胞用PBS 洗滌2 次，調整細胞濃度為1 ×106 / ml，加入PI (終濃度為50μg/mL)和RNA酶（終濃度為1μg/ml）， 室溫避光孵育1h后上機檢測，細胞增殖指數= ( S + G2 /M) / ( G0 /G1 + S +G2 /M) ×100%。

Western blot檢測細胞分化 分別提取轉pcDNA3.1 INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細胞總蛋白，兩株細胞以5％血清誘導分化一周后分別提取總蛋白，以β-actin為內參照，取等量的蛋白質經10%聚丙稀酰胺凝膠電泳后，轉至硝酸纖維素膜上， 用5%脫脂奶粉封閉1h，加10μg/ml抗GFAP單抗、抗MAP2單抗或抗β-actin單抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1h，漂洗后二氨基聯苯胺顯色2～3 min，水洗后照相。

Realtime RT-PCR 檢測細胞因子的表達 用Trizol試劑提取轉pcDNA3.1 INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的總mRNA，8453E型紫外分光光度儀（Agilent公司，美國）測定RNA濃度，參照SYBR ExScriptTM RT-PCR試劑盒說明操作，用等量的總mRNA進行逆轉錄，然后以逆轉錄產物為模板在LightCycler real-time PCR儀（羅氏公司，美國）上進行PCR反應，反應條件為：94℃預變性10 s，94℃變性5 s，60℃退火及延伸20s，共反應40個循環后，分析融解曲線，參照Livak等人的方法，以2－σσCT法分析細胞因子的的相對表達量[2]，引物列表見表1。

統計學處理　采用SPSS 12. 0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（ ±s）表示，不同細胞株間比較采用成組t檢驗，P < 0. 05為差異有統計學意義。

結 果

生長曲線的繪制 采用MTT法繪制的轉pcDNA3.1INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的生長曲線，見圖1。除接種后第一天外，各時點轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs加入MTT后，其570nm吸光度值均較相同時點轉pcDNA3.1 INPCs低，同時點兩株細胞間比較，差異有統計學意義。

流式細胞儀檢測細胞增殖指數 轉pcDNA3.1INPCs 及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的細胞增殖指數依次為61.64％±4.25％和46.19％±0.86％，兩者比較，差異有統計學意義。

Western blot檢測細胞分化 血清誘導分化后，兩株細胞MAP2的蛋白條帶極其微弱，GFAP條帶明顯，誘導分化前，轉pcDNA3.1INPCs 及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs均有明顯的MAP2條帶，而無明顯的GFAP條帶，兩株細胞間比較，MAP2和GFAP條帶的明暗程度在分化前及分化后無明顯差異。（見圖2）

細胞因子的表達 用Realtime RT-PCR的方法檢測轉pcDNA3.1 INPCs及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs細胞因子mRNA的相對表達量，如表2所示。將轉pcDNA3.1INPCs相應細胞因子的表達量定義為1，兩株細胞TNF-α的mRNA表達差異無統計學意義，轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs中IL-6 及IL-1β mRNA的表達較轉pcDNA3.1的INPCs低，差異有統計學意義。

討 論

神經前體細胞具有不斷分裂增殖、自我更新以及多分化潛能[3]。轉pcDNA3.1INPCs 及轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs的培養和傳代證實，轉入IκBα突變型基因后，INPCs仍能不斷分裂增殖，保持了自我更新的特性。而western blot通過半定量的方式證實，轉入的外源基因并未影響INPCs的分化特性，即血清誘導分化后大部分細胞表達作為星形膠質細胞標志的GFAP，分化為星形膠質細胞，僅有少量細胞表達作為神經元標志的MAP2，分化為神經元。增殖和分化潛能的保持即證實了轉pcDNA3.1/IκBαM INPCs保持了神經前體細胞的特性，同時也是該細胞株用于細胞移植治療的基本保證。

篇4

【摘要】 目的 觀察RNA 干擾技術沉默Annexin1基因表達對膀胱癌T24細胞增殖能力的影響。方法 針對Annexin1基因不同部位設計并化學合成3對不同的靶向小干擾RNA(siRNA)，脂質體介導瞬時轉染膀胱癌T24細胞，轉染后應用半定量RTPCR和Western印跡法檢測Annexin1 mRNA和蛋白的改變，透射電鏡觀察細胞凋亡情況，用MTT法檢測沉默Annexin1表達對膀胱癌T24細胞增殖的影響。結果 轉染siRNA后膀胱癌T24細胞Annexin1 mRNA和蛋白水平顯著下降(P

【關鍵詞】 膀胱癌;Annexin1;siRNA

【Abstract】 Objective To explore the effects of Annexin1 gene silencing by small interfering RNA(siRNA) on bladder cancer cells T24 in vitro. Methods Three siRNA targeting three different domains of Annexin1 gene were designed， synthesized， and transfected into bladder cancer T24 cells by lipofectamineTM2000. After transfection， expression of Annexin1 was detected by RTPCR and Western blotting. Transmission electronic microscope(TEM) was applied to observe the apoptosis cellular morphology. The cellular proliferation inhibitory ratio was evaluated by MTT assay. Results Compared with the negative control (siRNANC) groups， transfection of three targeting siRNA in T24 cells decreased the expression of Annexin1 mRNA and protein. Annexin1 gene silencing reduced the proliferative capacity of T24 cells and leaded to tumor cells apoptosis after transfection. Conclusions The chemically synthesized specific siRNA targeting Annexin1 could effectively reduce the expression of Annexin1 gene， reduce the proliferative capacity of T24 cells and induce tumor cells apoptosis.

【Key words】 Bladder cancer; Annexin1; siRNA

膜聯蛋白1(Annexin1)增強感染局部的凋亡表明它對腫瘤的診斷和治療有重要意義，因此該蛋白質與腫瘤細胞的活性調節相關〔1，2〕。目前，Annexin1的表達缺失是否與膀胱癌細胞的異常增殖潛力相關以及對化療藥物的敏感性尚未明了，本研究利用RNA干擾(RNAi)技術通過沉默Annexin1基因直接觀察Annexin1表達缺失對膀胱癌細胞體外增殖能力的影響，為進一步揭示該基因促進腫瘤進展的機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌T24細胞株(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院中心實驗室提供)，RNA干擾試劑盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)購自美國Ambion公司。陽離子脂質體轉染試劑盒LipofectamineTM2000、Trizol、MMLV購自Invitrogen 生命技術公司。RPMI1640、IMDM、胰蛋白酶購自GIBCO公司。

1.2 小干擾RNA(siRNA)的設計及合成 根據GenBank 中Annexin1基因序列(GenBank Accession No.NM000700)和siRNA設計原則，應用Ambion生物公司的設計軟件(siRNA Target Finder and Design Tools)，自Annexin1 mRNA的起始密碼子開始，尋找“AA”二連序列，記下其3′端的19個堿基序列作為候選的siRNA靶序列。將候選序列在GenBank中用Blast軟件進行同源序列搜索，排除那些和其他基因編碼序列或EST同源的候選序列。最終選擇了3段21個堿基的siRNA序列(TI、TⅡ、TⅢ)，分別靶向Annexin1基因的240260 (SI) ，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)區域(見表1)。另外，根據轉染后細胞形態學變化，設計與TI(240siRNA)序列含有同樣核苷酸比例的隨機對照siRNA(240c1，240c2)做為陰性對照，用Blast驗證隨機序列與GenBank中其他已知人類基因序列沒有同源性。利用針對三磷酸甘油醛脫氫酶(βactin)基因的正、反義寡核苷酸模板作為RNA干擾實驗的陽性對照。設計的正反義寡核苷酸模板3′端均加上T7啟動子引物5′CCTGTCTC3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 引物的設計與合成 設計1對Annexin1的引物，上游：5′GACCACCTCAACTCAAGGAC3′，下游：5′AGGAAGCTGGATGAAGAGAC3′，長度 546 bp，同時設計1對管家基因βactin引物，上游：5′ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG3′，下游：5′AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3′，長度290 bp，由上海生工合成。

1.4 細胞培養 常規RPMI1640培養，至轉染前夜，細胞培養液更換為用無血清和無抗生素的IMDM，置于37℃、 5% CO2孵箱，轉染后用20%FBS IMDM培養液，按常規方法培養，取處于對數生長期的細胞用于實驗。用OptiMEMⅠ轉染液及脂質體LipofectamineTM 2000轉染試劑，按試劑盒說明優化轉染條件，分別將3對siRNA和陽性對照篩選出的干擾序列的scramble siRNA(siRNAneg)以400 nmol/L的終濃度加入細胞培養液，孵育24、48、72 h后收獲細胞進行檢測。實驗重復3次。表1 靶向Annexin1的siRNA核苷酸序列

1.5 半定量RTPCR檢測轉染前后膀胱癌T24 細胞Annexin1 mRNA 的表達水平 Trizol試劑盒提取細胞總RNA，用2 μg總RNA進行cDNA的合成，半定量RTPCR方法檢測siRNA轉染后不同時間點24、48、72 h細胞中Annexin1 mRNA表達水平，βactin作內對照。PCR 擴增條件Annexin1：95℃預變性5 min;94℃變性40 s，58℃復性1 min，72℃延伸1 min，共33個循環;72℃延伸10 min。βactin：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環;72℃延伸10 min。取適量PCR擴增產物，在2%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，25 min)，EB染色，紫外燈下觀察結果并拍照。

1.6 Western印跡法檢測轉染前后膀胱癌T24細胞Annexin1蛋白的表達 取狀態良好對數生長期細胞5×106個，用PBS洗2遍，于冰上加冷的細胞裂解液，制備細胞總蛋白，Lowry法蛋白定量。將樣品置于5×SDS凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱10 min使蛋白質變性，丙烯酰胺凝膠電泳，Western印跡法，按0.1 ml/cm2的量加入封閉液和適量稀釋的抗體，于搖床上室溫2 h，PBS漂洗濾膜3次，加入辣根過氧化物酶標記二抗，將漂洗過的硝酸纖維素膜移至上述底物溶液中，輕輕搖動，蛋白條帶的顏色達到要求，即用水沖洗，濾紙吸干，拍照，保存。內參對照使用小鼠抗人βactin(稀釋度為1∶10 000)。

1.7 siRNA和脂質體的細胞毒性檢測 細胞用無血清和無抗生素的培養液洗滌重懸，每孔2×104加入96孔板。分別加入用OptiMEMⅠ稀釋的siRNA(終濃度為100 nmol/L)或Lipofectamine2000(終濃度為2 ml/L)，6 h后加入含20%血清的培養液補足血清，72 h后分別加入5 mg/ml的MTT，每孔20 μl，37℃置4 h，棄上清，每孔加入100 μl二甲基亞砜，待甲瓚完全溶解后，測定其在570 nm的吸光度，并計算細胞存活率。對照孔細胞中加入等量的OptiMEMⅠ代替脂質體或siRNA，其余培養條件與處理組相同。存活率(%)=(處理孔OD570-空白孔OD570)/(對照孔OD570-空白孔OD570)×100%。

1.8 透射電鏡觀察細胞凋亡形態 取細胞1×107個，冷PBS洗3遍，預冷2%戊二醛于4℃固定細胞2 h，冷PBS洗3遍，1%四氧化鋨酸4℃再固定30 min，常規電鏡脫水、包埋并超薄切片，用醋酸雙氧鈾和鉛染液雙重染色，觀察細胞超微結構。

1.9 MTT法檢測細胞增殖能力的改變 對數生長期細胞接種于96孔培養板，每孔接種1×105個細胞，在37℃，5%CO2細胞培養箱中培養，24 h后換用無血清的培養基。實驗組設7個不同藥物濃度，按相同倍數遞增。每組藥物濃度設6個復孔，對照組不加藥物，繼續培養24～96 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)孵育4 h后吸棄培養液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩溶解10 min，酶聯免疫檢測儀490 nm波長測吸光度值(A)，細胞增殖抑制率計算公式為：抑制率(%)=(1-實驗組A均數/對照組A均數)×100%，繪制生長曲線，重復3次。

1.10 統計學處理 應用SPSS11.0軟件對數據進行統計分析，數據結果以x±s表示，兩組均數間比較采用雙尾Student′s t檢驗，多組均數間比較采用方差分析(ANOVA)。

2 結 果

2.1 siRNA對膀胱癌T24細胞Annexin1 mRNA表達的影響 經AlphaEaseFCTM(Alpha Innotech)軟件分析，以40 nmol/L濃度轉染T24細胞24 h后siRNAⅠ、Ⅱ、Ⅲ組mRNA表達水平明顯降低(圖1)，在24 h下調(80.63±0.24)%(t=474.3，P=0.001);在48 h下調(38.9±0.85)%(t=64.833，P=0.01)，72 h恢復正常。

2.2 siRNA對膀胱癌T24細胞Annexin1蛋白表達的影響 與隨機對照相比，靶向Annexin1的siRNA轉染后細胞內Annexin1蛋白表達明顯下降，與RTPCR結果一致。見圖2。

1：Marker DL200，2：siRNA 轉染24 h，3：siRNA轉染48 h，4：siRNA 轉染72 h，5：siRNA陰性對照，6：未轉染組

圖1 siRNA對膀胱癌T24細胞

Annexin1 mRNA表達的影響

2.3 沉默Annexin1基因對T24細胞增殖能力的影響 轉染siRNA Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ序列靶向降低Annexin1基因表達后T24細胞的體外增殖能力明顯降低(圖3)，以未轉染的細胞做對照，轉染siRNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ后24、48、72 h細胞增殖抑制率分別是siRNA I：0.98/0.73/0.49倍，siRNA Ⅱ：0.97/0.65/0.41倍，siRNA Ⅲ：0.91/0.55/0.39倍，其中48、72 h組差異有統計學意義。

圖2 siRNA對膀胱癌T24細胞Annexin1蛋白表達的影響圖3 沉默Annexin1基因對T24細胞增殖能力的影響

2.4 細胞凋亡的形態學觀察 對照組腫瘤細胞未發生凋亡，細胞核形態正常，核內異染色質未發生固縮現象，核仁清楚;細胞質中原生質著色均勻;線粒體結構完整;嵴無斷裂(圖4a)。經過siRNA作用48 h后的T24細胞出現典型凋亡細胞特征(圖4b)，凋亡小體形成;異染色質已發生固縮，核仁消失;細胞質中出現空泡;原生質著色不均勻;線粒體擴張;嵴腫脹、斷裂。

圖4 siRNA作用前后的T24細胞

2.5 siRNA和脂質體的細胞毒性檢測結果 T24細胞經靶向Annexin1基因的siRNA或oligo Lipofectamine處理后計算細胞存活率，與未處理的T24細胞相比，沒有顯著統計學差異，顯示siRNA及脂質體本身在實驗條件下對細胞基本沒有毒性作用。

3 討 論

RNAi是由雙鏈RNA分子在mRNA水平關閉相應序列基因表達使其沉默的過程，是一種典型的轉錄后基因調控方法，此時啟動子是活躍的，靶基因能夠被轉錄，但不能正常累積mRNA。其優點首先表現在siRNA只引起與其同源的mRNA降解，而其他基因的表達不受影響，因此具有高度的序列專一性。許多實驗證實，導入細胞的siRNA只能引起同源基因表達的抑制，而無關基因不受影響〔3〕。在siRNA序列中配對的19～21nt中如果只改變一個核苷酸，就可以使該siRNA序列不對靶mRNA起作用，證明RNAi有明顯的特異性。其次RNAi是通過自身放大機制來發揮作用，極少量的dsRNA就能有效地抑制靶基因的表達，因此與反義寡核苷酸等基因封閉技術相比，具有高效性〔4〕。另外RNAi操作簡便快捷，利用RNA干擾技術，甚至可以在一周之內可以關閉10個基因。

2001年，Elbashir等首次報道siRNA在哺乳動物體外培養細胞中能夠成功的誘導特異基因受阻〔5〕。作為一種有效抑制基因表達的方法，RNA干擾技術在近幾年被廣泛用于基因的功能研究。雙鏈siRNA的合成是進行RNAi研究的關鍵〔6〕，本研究采取體外轉錄法，即在噬菌體RNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶等作用下，以連有噬菌體啟動子的線性DNA為模板，直接合成出特異雙鏈siRNA。RNA聚合酶是體外轉錄合成siRNA的關鍵酶，除了本實驗中用到的T7 RNA聚合酶，其他通用的RNA聚合酶還有T3、SP6 RNA聚合酶，它們均是以DNA為模板的RNA聚合酶。DNA模板必須連有特異的啟動子序列，啟動子區域是噬菌體RNA聚合酶結合和RNA開始合成的部位，因此本實驗在設計寡核苷酸模板的時候，3′端均加上T7啟動子引物5′CCTGTCTC3′。在RNA聚合酶結合到雙鏈DNA啟動子后，聚合酶分開雙鏈DNA模板，并以3′5′鏈作為模板合成出互補的5′3′RNA鏈，合成出的正反義RNA鏈經雜交即可得雙鏈RNA。在本研究中，以AA開頭針對597 bp的Annexin1 cds區的靶序列共有26個，其中GC堿基含量在50%以下的有25個，對其進行Blast分析，最終選擇了240260 (SI)，435455 (SⅡ)和 506526 (SⅢ)的3段序列，其中SI SiRNA靶序列的GC含量為43.9%，SⅡ SiRNA靶序列的GC含量為39.2%，SⅢ SiRNA靶序列的GC含量為41.2%。結果表明3段siRNA序列都有抑制Annexin1基因表達的作用，但是SⅡ siRNA抑制作用要更強一些。通過研究3對不同的靶向干擾序列和1對陰性對照序列，發現在mRNA水平3對靶向序列均可抑制Annexin1的表達，在蛋白水平也獲得較高的抑制效果。MTT結果發現，與未轉染細胞或轉染陰性對照細胞相比，轉染siRNA可顯著抑制T24細胞的生長，增加G0/G1期比例，誘導腫瘤細胞凋亡，與Mariotti〔7〕報道一致。總之，本研究通過siRNA下調Annexin1基因表達，導致細胞周期發生改變使細胞增殖緩慢和凋亡，為Annexin1與膀胱癌臨床相關性和治療新途徑提供了實驗依據。

參考文獻

1 SilistinoSouza R，RodriguesLisoni FC，Cury PM，et al.Annexin 1：differential expression in tumor and mast cells in human larynx cancer〔J〕. Int J Cancer，2007;120(12):25829.

2 Ang EZ，Nguyen HT，Sim HL，et al.Annexin1 regulates growth arrest induced by high levels of estrogen in MCF7 breast cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2009;7(2):26674.

3 Dalzell JJ，McMaster S，Fleming CC，et al.Short interfering RNAmediated gene silencing in Globodera pallida and Meloidogyne incognita infective stage juveniles〔J〕.Int J Parasitol，2010;40(1):91100.

4 PalBhadra M，Bhadra U，Birchler JA.RNAi related mechanisms affect both transcriptional and posttranscriptional transgene silencing in Drosophila〔J〕.Mol Cell，2002;9(2):31527.

5 Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature，2001;411(6836)：4948.

篇5

關鍵詞：生物科學；核心課程；邏輯關系

中圖分類號：G633.91

文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2016）21-0130-03

1 引言

生物化學、遺傳學、細胞生物學、分子生物學、基因工程學是生物科學專業的核心課程，由于它們相互聯系，交叉滲透，因此存在邏輯關系不清，課程內容重疊較多等問題，例如原核生物和真核生物基因表達調控在生物化學、細胞生物學、分子生物學都有介紹，基因工程原理在分子生物學、基因工程學中都有介紹，導致教師教學內容難以起舍，課程順序難以安排。要理順生物化學、遺傳學、細胞生物學、分子生物學、基因工程學的邏輯關系，確定各課程教學內容和教學順序，必須把其定義，研究內容，發展歷史動態結合起來。

2 生物科學專業核心課程概述

2.1 生物化學

生物化學是運用化學的理論和方法研究生物分子結構與功能、物質代謝及遺傳信息傳遞與調控規律的科學。

生物化學是生命科學中最古老的學科之一。 隨著生命科學的發展，各學科相互滲透。18世紀，一些從事化學研究的科學家轉向生物領域，為生物化學的誕生播下了種子。19世紀末，生物化學從生理化學中獨立。20世紀中后期又從生物化學分離出部分內容與遺傳學部分內容結合為分子生物學，然后，分子生物學基因操作部分獨立出來，形成基因工程學。

1920年以前，生物化學研究內容以分析生物體的化學組成、性質和含量為主，稱為靜態生物化學時期。

1920年-1950年，隨著同位素示蹤技術、色譜技術等物理學手段的廣泛應用，生物化學從單純的組成分析深入到物質代謝、能量轉化，如：光合作用、生物氧化、糖、脂肪、蛋白質代謝等領域。這是生物化學飛速發展的時期，稱為動態生物化學時期。

1950年以后，蛋白質化學和和核酸化學進展迅速，生物化學進入了分子生物學時期。分子生物學的發展揭示了生命本質的高度有序性和一致性，是人類在認識的巨大飛躍。根據生物化學的定義和歷史，生物化學研究的內容包括以下幾個方面。

2.1.1 生物的物質組成

生物是由一定的物質按特定的方式組成的，直到今天，新物質仍不斷被發現。如陸續發現的干擾素、環核苷一磷酸、鈣調蛋白、粘連蛋白、外源凝集素等都具有重要的生物學功能。另一方面，早已熟知的化合物也發現了新的功能，如20世紀50年代才知道肉堿是一種生長因子，而到60年代又發現其是生物氧化的載體。

2.1.2 物質代謝

生物體內絕大部分物質代謝是在酶催化下進行的，具有高度自動調節能力。一個小小的細胞內，有近2000種酶，在同一時間內，催化各種不同的化學反應。這些化學反應互不干擾，有條不紊地進行。表明生物體內的物質代謝有精確的調節控制系統。

2.1.3 結構與功能

生物大分子的功能與其特定的結構有密切關系。如酶的活性中心的結構決定其催化活性及其特異性；變構酶的活性還與其催化的代謝終末產物的結構有關。

核酸中核苷酸排列順序的不同，其結構就不同，所含遺傳信息不同。這些不同的構象對基因的表達具有調控作用。

生物體的糖包括多糖、寡糖和單糖。由于多糖鏈結構復雜，具有很大的信息容量，對于細胞專一地識別、相互作用具有重要作用。糖類將與蛋白質、核酸并列成為生物化學的主要研究對象。

在生物化學中，有關結構與功能關系的研究才僅僅開始，尚待大力研究的問題很多，其中重大的有：亞細胞結構中生物大分子間的結合，細胞的相互識別、細胞的接觸抑制、細胞間的粘合、抗原與抗體的作用、激素、神經介質與其受體的相互作用等。

2.1.4 繁殖與遺傳

生物典型特點是具有繁殖與遺傳特性。基因是DNA分子中的一段核苷酸序列，現在DNA分子的核苷酸序列已不難測得，不但能在分子水平上研究遺傳，而且還可能改變遺傳，從而派生出基因工程學。

2.2 細胞生物學

細胞生物學是從顯微水平、亞顯微水平和分子水平研究細胞的結構及其生命活動規律的科學。

過去，細胞生物學主要是在光學顯微鏡下對細胞的形態結構和生活史進行研究，稱為細胞學。20 世紀 50 年代以來，由于電子顯微鏡、放射性同位素、細胞結構組分分離技術、細胞培養等技術的廣泛應用，特別是分子生物學的興起，使細胞生物學研究的廣度和深度都有迅猛發展，從宏觀到微觀、從平面到立體、從定性到定量、從分析到綜合；從細胞、亞細胞、分子三個水平研究細胞的結構與功能、分裂與分化、衰老與死亡等生命活動規律及其調控機制，細胞與細胞、細胞與環境之間的相互關系。使原來以形態結構研究為主的細胞學轉變成以生理功能研究為主、將結構與功能緊密結合起來的細胞生物學。由于細胞生物學在分子水平上的研究工作取得了深入的進展，因此細胞生物學又稱為細胞分子生物學。細胞生物學研究內容如下。

2.2.1 細胞社會學

細胞社會學是細胞生物學中的一個新的領域。它是以系統論的觀點研究細胞群體中細胞間的相互關系、細胞群體的社會行為；細胞識別、通訊、相互作用；整體和細胞群對細胞的生長、分化、形態發生和器官形成等活動的調控；細胞外環境對細胞的影響。

2.2.2 細胞的增殖、生長、分化與調控

研究細胞增殖、生長、分化及其調控機制，不僅是控制生物生長和發育的基礎，而且是研究細胞癌變和逆轉的重要途徑。

2.2.3 細胞遺傳學

細胞遺傳學從細胞學角度來研究染色體的結構和行為以及染色體與細胞器的關系，從而探討遺傳與變異的機制等。

2.2.4 細胞化學

細胞化學：用切片或分離細胞成分，對單個細胞或細胞各個部分進行定性和定量的化學分析，研究細胞結構、化學成分的定位、分布及其生理功能。

2.2.5 分子細胞學

分子細胞學：從分子水平研究細胞與細胞器中蛋白質、核酸等大分子的組成、結構與功能及其遺傳性狀的表現和調控等，探討細胞生命活動的分子機理。

2.3 遺傳學

遺傳學是研究生物遺傳和變異規律的科學。孟德爾認為生物性狀的遺傳是受遺傳因子控制的，并提出了遺傳因子分離和自由組合的基本遺傳規律。1900年，孟德爾的成果得到廣泛重視，成為遺傳學的基石。

20世紀初，利用光學顯微鏡發現了細胞有絲分裂和減數分裂過程中染色體及其行為，奠定了遺傳的染色體理論基礎。1910年左右，美國遺傳學家摩爾根及其同事根據對普通果蠅的研究，提出了基因的連鎖交換規律，并結合當時的細胞學成就，創立了以染色體遺傳為核心的細胞遺傳學。

遺傳信息在分子水平上研究始于20世紀40年代。隨著電子顯微鏡的發明，人們已能夠直接觀察遺傳物質的結構及其在基因表達過程中的特征，使細胞遺傳學的研究進入分子水平。

1953年，沃森和克里克提出了DNA的雙螺旋結構模型，為進一步闡明DNA的結構、復制和遺傳物質如何保持世代連續的問題奠定了基礎，開創了分子遺傳學這一新的學科領域。

遺傳學研究的領域非常廣泛，可劃分成經典遺傳學、細胞遺傳學、分子遺傳學和生統遺傳學4個分支，各個分支領域相互聯系、相互重疊、相互印證，組成了一個不可分割的整體。

經典遺傳學研究從親代到子代的遺傳特性，包括遺傳的分離規律；獨立分配規律；連鎖和交換遺傳規律及機理；基因互作及其與環境的相互關系；性別決定與伴性遺傳；基因及染色體變異；數量性狀的特征及其多基因假說，近親繁殖和雜種優勢；細胞質遺傳等。

細胞遺傳學是通過細胞學手段對遺傳物質進行研究。其內容包括細胞的結構和功能；染色體的形態結構；細胞的有絲分裂，減數分裂；配子的形成和受精。

分子遺傳學是從分子的水平上研究遺傳物質的結構及遺傳信息的傳遞。內容包括DNA復制、轉錄和翻譯，基因突變及修復，原核生物和真核基因表達與調控；基因、基因組及作圖，遺傳重組。

生統遺傳學是用數理統計學方法來研究生物遺傳變異規律的學科。根據研究的對象不同，又可分為數量遺傳學和群體遺傳學。前者研究生物體數量性狀即由多基因控制的性狀遺傳規律，后者是研究基因頻率在群體中的變化、群體的遺傳結構和物種進化。

2.4 分子生物學

分子生物學是從分子水平研究核酸與蛋白質的結構與功能、遺傳信息傳遞和調控，闡明生命本質的科學。

從19世紀后期到20世紀50年代初，確定了蛋白質是生命的主要物質基礎，DNA是生物遺傳的物質的載體，是現代分子生物學誕生的準備和醞釀階段。

從20世紀50年代初到70年代初，是現代分子生物學的建立和發展階段，1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結構模型為現代分子生物學誕生的里程碑，確立了核酸作為遺傳信息分子的結構基礎，提出了鹼基配對是核酸復制、遺傳信息傳遞的基本方式，為核酸與蛋白質的關系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎。

70年代后，基因工程技術出現，人類進入認識生命本質并開始改造生命的發展階段。

分子生物學原來是生物化學的一部分，因其太重要了，20世紀中后期從生物化學中分離出來并與遺傳學結合，獨立出來成為單獨的學科，是生物化學的發展和延續。涉及的部分內容比生物化學更細致深入，并從整體上考慮。

分子生物學從蛋白質、核酸、基因及基因組結構開始，以中心法則為主線，闡述生物大分子在信息傳導、基因表達調控中的相互作用和機理。主要內容包括蛋白質、核酸、基因和基因組的結構、DNA的復制、轉錄、轉錄后加工、基因突變與修復、蛋白質生物合成和翻譯后加工、原核生物基因表達的調控、真核生物基因表達的調控。基因工程技術的原理和應用等。

2.5 基因工程學

20世紀70年代，隨著 DNA的內部結構和遺傳機制逐漸呈現在人們眼前，生物學家不再僅僅滿足于探索、揭示生物遺傳的秘密，而是開始設想在分子的水平上去干預生物的遺傳特性。這就像工程設計，按照人類的需要（設計）把這種生物的某個“基因”與那種生物的某個“基因”進行“施工”，“組裝”成新的基因組合，創造出新的生物的工程技術被稱為“基因工程”。

基因工程包括如下幾個主要的內容：①目的基因的合成或提起分離。②載體的構建。③將載體轉移到受體細胞并增殖。④重組DNA分子的受體細胞克隆篩選。⑤將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，產生出人類所需要的物質。

3 課程間的邏輯關系，教學內容選擇及課程順序安排

從生物化學、遺傳學、細胞生物學、分子生物學、基因工程學的定義，研究內容，發展歷史動態可知，各學科的邏輯關系是：理解細胞結構及功能需要一定的生物化學基礎，理解遺傳物質的結構和功能需要一定的細胞生物學基礎，而分子生物學是生物化學、遺傳學交叉融合的產物，研究核酸和蛋白質分子結構和功能以及相互關系，而各個分子不能孤立發揮作用，必須依賴于一定的細胞結構，因此，生物化學是細胞生物學的基礎；細胞生物學是遺傳學和分子生物學的基礎。基因工程是利用分子生物學的理論和實驗技術進行轉基因操作的部分獨立出來的，因此分子生物學是基因工程學的基礎。所以，高校應按生物化學、細胞生物學、遺傳學、分子生物學、基因工程的順序安排課程教學最為合適。

由以上可知，由于歷史的原因，生物化學、細胞生物學、遺傳學、分子生物學、基因工程學相互聯系，交叉滲透，研究內容重復較多。因此，本研究根據其定義、邏輯關系及發展歷史，同時為編寫教材和教學的方便，建議生物化學、遺傳學、細胞生物學、分子生物學、基因工程學教學內容如下。

（1）生物化學主要教學內容主要有：蛋白質化學、核酸化學；酶學基礎；糖代謝與生物氧化；脂類代謝；蛋白質的分解代謝等內容。而將DNA復制、轉錄、翻譯、突變、修復及原核生物和真核生物基因表達調控留在分子生物學講授。

（2）細胞生物學的教學內容主要有：細胞的基本結構；細胞生物學研究方法；細胞膜的結構與功能及物質跨膜運輸；細胞質基質與細胞內膜系統；細胞通訊與信號傳遞；線粒體和葉綠體；細胞核與染色體；細胞骨架；細胞增殖及其調控；細胞分化、衰老與凋亡。

（3）遺傳學的教學內容主要有：遺傳的分離規律；獨立分配規律；連鎖和交換遺傳規律；基因互作及其與環境的關系；基因定位與連鎖遺傳圖；性別決定與伴性遺傳；基因及染色體變異；染色體畸變；數量性狀的特征及其多基因假說；近親繁殖和雜種優勢；細胞質遺傳；遺傳重組。

（4）分子生物學的教學內容主要有：DNA的復制、轉錄、轉錄后加工、基因突變與修復、蛋白質生物合成和翻譯后加工、原核生物基因表達的調控、真核生物基因表達的調控。

（5）基因工程學的主要教學內容有：基因工程技術的原理和應用等。

以上各門課的教學內容相對前述和我國現行教材的教學內容作了較大調整，例如；核酸和蛋白質的組成及結構只在生物化學中講授，細胞信號傳遞只在細胞生物學中講授，基因工程原理只在基因工程學中講授，避免了課程內容的重復。

參考文獻：

[1]沈振國.細胞生物學（第2版）[M].北京：中國農業出版社，2011.

[2]歐陽五慶.細胞生物學[M].北京：高等教育出版社，2010.

[3]翟中和，王喜忠，丁明孝.細胞生物學[M].北京：高等教育出版社，2007（8）.

[4]George M.Malacinski，David Freifelder.essentials of molecular biology（third edition）[M].北京：科學出版社，2003.

[5]Jeremy M.Berg，John L. Tymoczko，Lubert Stryer[J].Biochemistry，2002.

[6]徐晉麟.現代遺傳學原理[M].北京：科學出版社，2000.

[7]王亞馥，戴灼華.遺傳學[M].北京：高等教育出版社，1999.

[8]孫乃恩.分子遺傳學[M].南京：南京大學出版社，1990.

[9]Robert H.Tamarin：Principles of Genetics[J].5th ed.，1996.

[10]朱玉賢，李 毅.現代分子生物學[M].北京：高等教育出版社，2002.

[11]楊業華.普通遺傳學[M].北京：高等教育出版社，2000.

[12]Hartwell L，Hood L，Goldberg M L，et al.Genetics：From genes to Genomes（first edition）[J].McGraw-Hill Companies，Boston，2000.

[13]馬建崗.基因工程學原理[M].西安：西安交通大學出版社，2001.

篇6

河北大學臨床醫學院河北省保定市071000【摘　要】關于腫瘤發生機制的研究雖然已有百年的歷史，但時至今日依然沒有完全解開。隨著越來越多的實驗結果不能用傳統的體細胞突變學說解釋，一些新的學說如腫瘤干細胞學說應運而生。本文就腫瘤干細胞的起源、特性與應用作一簡要分析。

關鍵詞 腫瘤干細胞；研究；分析

1959年，Makino提出腫瘤干細胞（tumorstemcells，TSC）假說并認為腫瘤細胞是由與正常干細胞相似的一小部分細胞分化而成的，但很長時間此假說并未得到重視。直到1997年Bonnet[1]etal成功分離出并證實了表型為CD34+/CD38-的白血病干細胞，加上人們對體細胞突變理論正確性的逐漸質疑，TSC假說在當時得到了廣泛關注，直到今天，TSC的相關研究依然是主流熱點之一。

1腫瘤干細胞的起源

關于腫瘤干細胞的起源目前尚無定論。Clark[2]etal認為TSC來自正常干細胞，因為其在生物學特性等方面與正常干細胞相似；國內學者王瑞安[3]提出“干細胞錯位學說”并認為浸潤癌的產生是由于上皮性干細胞誤入結締組織間質而形成。另有學者認為其起源于分化成熟的細胞去分化所得。但不論如何，腫瘤干細胞與正常干細胞生物學行為的相似性這點毋庸置疑，因此大部分學者認為腫瘤干細胞是通過某種方式由正常干細胞轉化而來。

2腫瘤干細胞的特性

TSC與正常組織干細胞在生物學特性上具有較多相似性，比如具有較強增殖的能力，并且能自我克隆出子代TSC和分化出其他腫瘤細胞；TSC也存在正常組織干細胞不具備的生物學特性。一般認為，干細胞對化放療敏感，而TSC對化放療具有較強耐受力，且此能力會隨著化放療的進程而加強。Woodward[3]etal研究表明，在對乳腺癌放療后TSC比例并未下降反而增高；Lagadec[4]etal進行動物實驗時發現，放射線照射后的乳腺癌干細胞轉化為乳腺癌細胞的能力是原先的30倍，傳統的化放療治療并未對TSC產生有效作用，反而促進了腫瘤的復發，可能這就是目前積極治療腫瘤后復發率仍然較高的原因之一。

3腫瘤干細胞的應用

TSC假說的提出使人們逐漸轉變了傳統治療惡性腫瘤的思維，并在惡性腫瘤的治療中把注意力從殺滅腫瘤細胞轉移到積極殺滅TSC中去，目前已經有了一些成果：Li[5]etal通過實驗研究得出DCLK1是存在于結腸癌干細胞上的表面標識，并為TSC的靶向治療提供了基礎；Liu[6]etal發現Gd@C82(OH)22能夠調控腫瘤微環境，有效抑制乳腺癌干細胞自我更新，實現殺滅腫瘤干細胞，并能終止腫瘤發生與轉移。越來越多的研究表明，只有真正殺滅腫瘤干細胞，惡性腫瘤才能得到控制，其相關治療具有較好的應用前景。

4結語

腫瘤干細胞假說可以看做為體細胞突變學說的一個很好的發展或者糾正，雖然目前尚未能從普遍上證明TSC學說的正確性，但越來越多的實驗能夠證明TSC確實存在并影響腫瘤的發生。相信隨著研究的深入，腫瘤干細胞的研究將會取得更多進展并早日應用于臨床，從而為腫瘤的治療提供新的思路。

參考文獻

[1]BunnetD,DickJE.Humanacute myeloidleukemiaisorganizedasa hierarchythatoriginatesfroma primitivehematopoieticcell[J].NatMed,1997,3(7):730-737.

[2]ClarkMF,DickJE,DirksPB,etal.Cancerstemcellsperspectives oncurrentstatusandfuture directions:AACRWorkshoponcancer stemcells[J].CancerRes,2006, 66(19):9339-9344.

[3]WoodwardWA,ChenMS,BehbodF, etal.WNT/beta-ceteninmediates radiationresistanceofmouse mammaryprogenitorcells[J]. ProceedingsoftheNational AcademyofsciencesoftheUSA, 2007,104(2):618-623.

[4]LagadecC,VlashiE,DellaDonnaL,et al.Radiation-InducedReprogramming ofBreastCancerCells[J].Stem Cells,2012,30(5):833-844.

篇7

【關鍵詞】 耐萬古霉素；金黃色葡萄球菌；生物學特征；細菌檢測

金黃色葡萄球菌是社區獲得性肺炎的常見病菌，2002年首次報道耐萬古霉素葡萄球菌，2004年JAMA在職報道毅力患者體內分離出該病菌，臨床常用的檢測及藥敏試驗未能檢測出耐萬古霉素金黃色葡萄球菌[1]，我院采用萬古霉素體外誘導方法將1株，異質性萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌（h-VRSA）誘導為耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA），觀察其生物學特點，現報告如下：

1資料和方法

1.1一般資料 標準金黃色葡萄球菌（ATCC 29216）和異質性萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌分離菌株10833來源于我院檢驗科，血漿凝固酶（+），觸媒（+），GPI編碼：76134056712。

1.2方法卵磷脂吐溫80瓊脂，微量生化反應管，萬古霉素紙片，鹽酸萬古霉素、MH瓊脂、肉湯、GPI鑒定卡，聚合酶鏈反應（PCR）試劑、PCR擴增儀、ZF紫外分析儀。按照10827篩選方法操作，確認為h-VRSA，將該菌株接種于萬古霉素選擇性培養基內，誘導出VRSA，并接種于血瓊脂平板、兔血漿、MH肉湯，觀察菌落形態、溶血環及色素，應用手工法、儀器法、PCR法測定金黃色葡萄球菌基因序列[2]，采用菌譜分析法，檢測對萬古霉素的敏感性。

1.3 統計學處理 應用SPSS13．0軟件進行統計學處理，計數資料以％表示，計量資料以(x±s)表示，組內和組間比較分別采用t檢驗和x2檢驗。P

2結果

2.1 VRSA菌群特點與標準金黃色葡萄球菌比較見表1

表1 VRSA菌群特點與標準金黃色葡萄球菌比較

生物學形態 標準金黃色葡萄球菌 VRSA

菌落形態及大小 均勻 大小不均

溶血環 清晰、寬大 窄小、無

色素 淡黃 灰白

凝固酶 陽性 陰性

金黃色葡萄球菌耐藥后色素、溶血環消失，菌落變小，凝固酶陰性。

2.2VRSA實驗室檢測分析見表2

表2VRSA實驗室檢測分析

鑒定方法 標準金黃色葡萄球菌 VRSA

手工法 金葡菌 溶血葡萄球菌

儀器法 金葡菌 溶血葡萄球菌

PCR 金葡菌 金葡菌

實驗室常用細菌鑒定方法將其鑒定為溶血葡萄球菌或者模仿葡萄球菌，PCR檢測方法能正確鑒定VRSA誘導菌。

2.3 VRSA藥敏試驗結果紙片法和儀器法對于h-VRSA和VRSA均能檢測到，微量肉湯對VRSA能檢測到，對h-VRSA容易漏診。

3討論

萬古霉素通過與肽聚糖前體D-D丙氨酸-丙氨酸結合，組織轉糖基和轉肽作用，抑制細胞壁的合成，發揮殺菌作用，其耐藥機制尚未明了，有資料報名，金黃色葡萄球菌對萬古霉素的耐藥機制不是單一的。細胞壁增厚是其主要耐藥機制，增厚的細胞壁通過阻塞、親密誘捕引起耐藥，萬古霉素與丙氨酸殘基結合，阻塞其網狀結構[3]，阻止萬古霉素向細胞質膜滲透，同時細胞壁上增多的肽聚糖單體與萬古霉素結合，大部分藥物結合在細胞壁上，不能到達細胞質膜。金葡菌分泌一種肽，可以通過信息傳導途徑把耐藥質粒轉移到金葡菌體內。本次實驗表明，VRSA生物學特性改變主要是細菌菌落變小，色素消失，溶血環消失，凝固酶轉陰，細菌菌落變小，提示耐藥菌培養時間延長。VRSA生物學特征改變，對細菌鑒定結果也產生影響，手工法和儀器法錯誤鑒定為溶血葡萄球菌和模仿葡萄球菌，在采用PCR技術檢測VRSA的nuc基因[4]，特異性表達于金黃色葡萄球菌，可應用于VRSA和h-VRSA的鑒定，這說明耐藥菌生物學特征改變導致儀器法和手工法檢測錯誤，金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥后，生物學發生變化，容易導致細菌鑒定結果錯誤，應引起臨床重視。

參考文獻

[1] 馬筱玲，王敬華，李華，等．異質性萬古霉素耐藥葡萄球菌分離及生物學特性觀察[J]．中華微生物學和免疫學雜志，2009，24(7)：583―586．

[2] 馬筱玲．萬古霉素敏感性減低的金黃色葡萄球菌[J]．中華檢驗醫學雜志，2009，27(9)：620―622．

[3] Weigel LM ，Clewell DB，Gill SR，et a1．Genetic analy―sis of a high―Level vancomycin―resistant isolate ofStaphylococcus aureus[J]．Science，2008，302(28)：

篇8

關鍵詞：犬細小病毒；分離；鑒定

中圖分類號：S852.65+9.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）20-4576-03

犬細小病毒（Canine parvovirus，CPV）屬于細小病毒科細小病毒屬，為單股、負義、線形無囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性腸胃炎和心肌炎，并使白細胞大量減少，在幼犬中的發病率和死亡率都很高[2]。CPV對多種理化因素和常用消毒劑具有較強的抵抗力，在4～10 ℃存活6個月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在糞便中可存活數月至數年[3]；該病毒對乙醚，氯仿和醇類有抵抗力[4]。CPV一年四季均可發病，以冬、春多發[5]，飼養管理條件驟變、長途運輸、寒冷、擁擠均可促使該病發生[6]。病犬是主要傳染源，其嘔吐物、唾液、糞便中均有大量病毒[7]。根據臨床癥狀和血清學反應，可做出準確診斷[8-13]。本研究通過對山東毒株分離，并對其部分生物學特性進行研究，為該病的防治和后續研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM培養基為Gibco產品；小牛血清、谷氨酸胺、雙抗、胰蛋白酶等購自大連寶生物TaKaRa有限公司；其他化學試劑均為分析純試劑。

1.1.2 病料 病料為2009～2011年聊城大學獸醫院收集或其他養犬場送檢的可疑CPV病料，包括20份糞便樣品和10份臟器。

1.1.3 試驗動物和細胞 8只40～50日齡的山東細犬幼犬（抗CPV HI抗體效價小于1∶4），健康狀況良好；貓腎傳代細胞系（F81）和犬腎傳代細胞系（MDCK）等由聊城大學農學院實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑的配制

1）1%豬紅細胞懸液的制備。用20 mL注射器內吸入阿氏液3～5 mL，于健康豬前腔靜脈采血10～15 mL，立即混勻，4 ℃保存備用。使用時用PBS洗滌保存的豬紅細胞，1 000 r/min離心5 min，洗滌3次，取紅細胞泥1 mL加稀釋液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即為1%豬紅細胞懸液。

2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀釋液25 μL，然后吸取25 μL經福爾馬林滅活的CPV細胞培養物，在血凝板上倍比稀釋，最后1孔不稀釋，作為陰性對照；接著每孔加稀釋液25 μL和1%豬紅細胞懸液50 μL，于振蕩器上振蕩1 min混勻，于4 ℃冰箱靜置1～2 h，待紅細胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%紅細胞凝集為終點，在對照孔紅細胞完全不凝集，呈圓形小點沉于孔底時，凝集終點的稀釋倍數即為該抗原的HA效價，將此效價除以8，即是8單位血凝抗原的稀釋倍數。

1.2.2 病料的處理

1）糞便樣品的處理：將病犬糞便用DMEM培養液稀釋（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混勻，4 000 r/min離心10 min，取上清，加入雙抗200 μL，4 ℃過夜，再經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存備用。

2）臟器樣品的處理。將臟器樣品用滅菌后的研磨器進行研磨，并反復凍融3次，同時加入9倍體積的DMEM細胞培養液，5 000 r/min離心25 min，取上清液，經過濾除菌。將處理好的樣品置-20 ℃保存，待分離鑒定。

1.2.3 血清樣品HI抗體效價的測定 取待檢血清0.2 mL，加入豬紅細胞懸液1滴，混勻于室溫吸收1 h，離心取上清液待檢。先用移液器向血凝板每孔加稀釋液25 μL，然后吸取待檢血清25 μL，在血凝板上倍比稀釋，最后2孔不稀釋作為對照，每孔加8單位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作為血清對照。加完后振蕩混勻，于4 ℃冰箱靜置1～2 h判定。判定的方法是以完全不凝集為終點，在抗原對照孔完全凝集，血清對照孔完全不凝集的情況下，血清出現終點抑制的稀釋倍數，即為該血清的HI效價。

1.2.4 病毒的分離 采用同步接毒法，在F81細胞消化傳代后，按培養液量體積的1/10接入處理過的樣品，37 ℃靜置培養3～5 d，每天觀察有無細胞病變。如無細胞病變，則于培養的第4～5 d收取上清，繼續按常規傳代培養，至第5代仍無病變判為分離結果陰性；若出現細胞病變則分離結果為陽性，反復凍融3次，收毒，-20 ℃保存。

1.2.5 生物學特性鑒定

1）理化特性。按《動物病毒學》[3]規定進行，取分離病毒的F81細胞培養物，分別做以下處理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振蕩10 min，放4 ℃過夜，并無菌揮發除去全部乙醚；將病毒液調節pH為3時于4 ℃作用處理1 h，再用0.1 mol/L NaOH調至pH 7.2，進行耐酸性試驗，然后分別用F81細胞測定其TCID50變化。

2）紅細胞血凝試驗。采用微量血凝（HA）試驗，分別用0.5%的雞、豬、大鼠、兔和人（O型）的紅細胞懸液測定病毒培養液的HA效價。

3）細胞敏感譜。選用貓腎傳代細胞系（F81）、犬腎傳代細胞系（MDCK）作為接種對象，分別分離得到HA效價≥1∶128的細胞培養液。按常規方法進行同步接毒，37 ℃靜置培養24 h后，換液，每天觀察細胞病變（CPE），4～5 d收獲凍融，再以同樣方法連傳5代，以出現CPE作為感染指標。

1.2.6 動物回歸試驗

用所分離的CPV分離株1，2和3（HA效價均為1∶512～1∶2 048）對試驗犬進行人工感染試驗。接種途徑為口服，劑量為5 mL，設空白對照組和試驗組。將幼犬隨機分為4組，每組2只。試驗Ⅰ組幼犬接種分離株1；試驗Ⅱ組幼犬接種分離株2；試驗Ⅲ組幼犬接種分離株3；將第4組設為空白對照，接種生理鹽水。對4組試驗犬進行隔離飼養。接種后，每天觀察試驗犬的臨床變化并進行體溫的測量，每3 d進行一次白細胞計數，自接種后5 d開始收集糞便，并進行CPV的HA/HI檢測。攻毒后觀察15 d，如無眼觀臨床癥狀、白細胞總數正常，則視為試驗犬健康。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

將處理后的病料接種F81細胞后，采用同步接毒進行病毒分離。在第一代細胞病變不明顯，但盲傳至第3～5代時，部分接毒細胞出現細胞圓縮、拉網和脫落等細胞病變，而對照細胞排列緊密，生長旺盛，呈不規則形（見圖1～2）。試驗共從3份病料中分離出病毒，分別命名為CPV分離株1、分離株2和分離株3。

2.2 生物學特性

1）理化特性。經50 ℃、20%乙醚和酸（pH 3.0）處理后，通過比較處理前后TCID50的變化發現TCID50效價相差都小于2個數量級，變化不大。說明分離毒株能抵抗乙醚、酸（pH 3.0）和熱（50 ℃），這與細小病毒理化特性一致。

2）紅細胞血凝結果。采用微量血凝試驗測定各病毒分離株對雞、豬、大鼠、兔和人紅細胞的HA效價。分離株對豬紅細胞的凝集效價達到1∶27～1∶210；而對其他紅細胞的血凝效價為20，沒有血凝性。與文獻記載的CPV血凝譜相符。

3）細胞感染譜。將CPV分離株在多種細胞上同步接毒培養5代，并每天觀察CPE。結果表明，有3株CPV分離株連續傳代后出現細胞病變現象，分別命名為分離株1、2、3。

2.3 動物回歸試驗結果

用病毒分離株感染幼犬后第5～6天，試驗組均發病。其中試驗Ⅲ組即接種CPV分離株3的2只幼犬在接種后第5天開始出現臨床癥狀，精神沉郁，嘔吐，排稀糞。隨后轉為拉血、脫水、食欲廢絕，最后死亡。

對病死幼犬病理剖檢發現空腸和回腸局部充血、粘膜脫落，腸系膜淋巴結腫脹，腸腔內有血樣糞便。其他2組試驗組犬接種后第6天表現出精神沉郁，體溫增高，食欲下降，拉稀便，但后來自行康復。所有接毒試驗犬的白細胞總數均出現不同程度的下降。但對照犬的白細胞總數沒有明顯變化。

試驗組犬在攻毒后5～8 d，幼犬糞便的HA效價為1∶128～1∶512，對照犬的糞便HA檢測結果均為陰性。

3 討論

3.1 病毒分離

本試驗通過采集疑似CPV感染犬的糞便和內臟，經處理后接種于貓腎細胞分離病毒，然后通過對分離病毒的生物學特性、血凝抑制試驗和動物回歸試驗等方法對病毒株進行了鑒定。

CPV無囊膜，用氯仿處理糞便可使有囊膜的病毒失活，有利于該病毒的分離和純化。部分出血很明顯的細小病毒樣本，反而沒有分離出病毒。可能因為在疾病中后期，由于腸道出血，血液中的犬細小病毒抗體和細小病毒形成抗原抗體復合物，造成樣品中的病毒量減少，細胞分離呈陰性。糞便中毒素和組織分解代謝產物會對培養細胞產生一定的影響。因此，如何處理糞便，盡量減少對細胞的毒性，成為能否成功分離病毒的關鍵。可以減少接種樣本數量（1/20～1/30），或接種后及時換液，可有效降低糞便中毒素對細胞的毒害作用，提高病毒分離率。CPV的復制須完全依賴宿主細胞DNA的復制機制，復制主要發生在細胞周期的S期晚期和G2早期，病毒的接種最好采用同步接種方式。所以，在試驗中采用了同步接毒的辦法。但由于樣本的毒性，可以在傳代后6～8 h再接種，能減少樣本對細胞的影響。

3.2 病毒鑒定

通過對分離的病毒進行理化鑒定，發現所分離的病毒具有抗酸、抗脂溶劑和耐熱的特性，與文獻報道的細小病毒的理化性質一致。通過對不同動物紅細胞的血凝譜測定，所分離病毒能夠凝集豬的紅細胞，不能凝集雞、兔和人的紅細胞，與報道的CPV的血凝譜一致。病毒除了能在F81細胞增殖外，病毒株2還可以在MDCK細胞增殖。病毒血凝抑制試驗進一步確認所分離的病毒血凝特性能夠被犬特異性細小病毒血清抑制，證明試驗中分離到的病毒為犬細小病毒。

3.3 動物回歸試驗

為了檢驗所分離犬細小病毒的致病性，進行了動物回歸試驗，分別將3株病毒人工接種試驗犬。動物試驗結果顯示，試驗組均發病，表現為拉稀、脫水、精神沉郁、食欲廢絕，對照組健康。

本試驗采用F81細胞同步接毒的方式從送檢的疑似CPV感染的30份樣品中分離出3份CPV陽性樣品。并對分離病毒進行了生物學和動物接種試驗，檢驗了分離病毒的致病性。其中分離株3可以引起接種幼犬死亡，表明是一株犬細小病毒的強毒株。本研究為犬細小病毒病的預防和控制提供了理論依據，同時為深入研究該病毒的致病機理奠定了基礎。

參考文獻：

[1] 馬景霞.犬細小病毒研究進展[J].山東畜牧獸醫，2008，29（5）：47-49.

[2] 趙世華，宋愛軍，陳偉，等.犬細小病毒（CPV）內蒙古分離株的體外培養特性研究[J].畜牧與飼料科學，2010，31（9）：168-169.

[3] 殷 震，劉景華.動物病毒學[M].第二版.北京：科學出版社，1997.

[4] 王淑君，楊松濤，陳創夫，等.犬細小病毒四川流行株分離鑒定及其遺傳進化分析[J].現代生物醫學進展，2009，9（10）：1888-1890.

[5] 劉志強，張小鶯，黃 新，等.新疆石河子地區犬細小病毒的分離鑒定與基因型分析[J].中國獸醫雜志，2010，46（8）：44-46.

[6] 蔡寶祥.家畜傳染病學[M].第5版.北京：中國農業出版社，2006：422-425.

[7] 戈 銳，彭廣能，夏咸柱，等.犬細小病毒四川株的分離與鑒定[J].中國預防獸醫學報，2007，29（11）：836-839.

[8] 楊龍峰，李英杰，艾萍萍，等.一株犬細小病毒的分離及VP2基因序列分析[J].山東畜牧獸醫，2011，32（1）：6-8.

[9] 易 立.犬細小病毒的分離鑒定、序列分析及VP2基因的融合表達[D].北京：中國農業科學院，2008.

[10] 杜 強，邱 薇，范泉水，等.犬細小病毒的分離鑒定[J].動物醫學進展，2009，30（3）：55-58.

[11] 宋桂強，龍貴偉，范泉水，等.犬細小病毒病的研究進展[J].中國畜牧獸醫，2007，34（3）：98-100.

篇9

1制造

1．1總體要求

重組DNA技術產品安全有效的保障，不僅需要對目標產品的原液和成品進行質量控制，而且還需要對起始原材料和工藝過程進行充分控制。即應對包括細胞株的來源、鑒別和檢測、發酵或細胞培養、生產中使用的其它原材料、驗證純化工藝去除不需要物質的能力(特別是可能存在的病毒污染物、來自連續培養哺乳動物細胞的殘余DNA、宿主細胞蛋白等)、生產工藝中的過程控制、因生產工藝的變化對產品質量安全和有效性的潛在影響，以及原液和成品全面的質量分析均給予必須和足夠的重視。

1．2起始原材料的控制

重組DNA技術產品須采用經過驗證的細胞庫系統進行生產，首先應將宿主與載體結合制備主細胞庫，再由主細胞庫制備工作細胞庫。并需建立相關文件，詳細描述培養、提取、純化的步驟以及對細胞庫批次的定義。如生產中使用人或動物來源的材料，則應符合病毒安全的有關要求。

1．1．1表達載體和宿主細胞應提供宿主細胞和表達載體起源、來源、遺傳背景和歷史的描述，包括克隆基因的來源和特性、該基因的構建和鑒別情況，以及表達載體遺傳特性和結構等詳細信息。同時應提供表達載體來源和各部分功能的說明，如:復制起始位點，啟動子，抗性標記，限制性內切酶圖譜等。詳細描述表達載體擴增、對宿主細胞的轉化方法，以及生產用細胞克隆的篩選判定標準。提供表達載體在宿主細胞中的位置和物理狀態、如是否整合到染色體上，以及拷貝數和遺傳穩定性資料。明確插入克隆基因、表達載體控制區及其兩側的核苷酸序列，與表達有關或與產

品質量相關的核苷酸序列均應詳細敘述。同時也應詳細描述在生產過程中控制、提高克隆基因在宿主細胞中表達水平的各種措施。1．1．2細胞庫系統重組DNA技術產品的生產中，其細胞庫系統通常包括主細胞庫和生產工作細胞庫。主細胞庫(maincellbank，MCB)由含目的基因表達載體轉化的原始細胞經傳代擴增制成的均一懸液，并以等體積分裝于單獨容器中用于儲存(如，在液氮中)。在某些情況下，可能需要分別建立表達載體和宿主細胞的主細胞庫。工作細胞庫(workingcellbank，WCB)是從主細胞庫經有限傳代而來的細胞材料的均一懸液，并以等體積分裝于單獨容器中用于儲存(如，在液氮中)。以上兩種細胞庫，所有的儲藏容器應在相同條件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回庫內儲藏。細胞庫類型、容量、在預期使用頻率下細胞庫的壽命、保存使用的容器和封閉系統、包括凍存劑、培養基、冷凍保存步驟和存儲條件等細胞庫制備的方法均應詳細記錄在案，并提供在已優化儲存條件下，庫存細胞穩定性的證據。

1．1．3細胞庫的控制應對主細胞庫包括重組蛋白表達和/或表達載體在內的相應表型和基因型標記進行鑒定。對特定主庫細胞基質的檢測，可根據細胞的生物學特性和培養的歷史背景進行相應調整，并且該鑒定的范圍和程度，可能會影響到后期生產階段細胞基質所需常規檢查的類型和級別。應采用分子生物學或其他適合的技術對表達載體基因拷貝數、基因插入或缺失、整合位點數量等情況進行分析。核酸酸序列應與表達載體一致，并與所預期表達的蛋白序列吻合。由于支原體、病毒等外源因子污染動物來源的細胞基質后，可以進行擴增，同時逆轉錄病毒等內源因子也會引發安全問題，因此對細胞基質內、外源病毒因子的檢測十分重要。應制定和建立細胞庫微生物有機體檢測的策略和方法，并考慮采用適當的檢測技術以確認某些特定病毒是否存在。通常受到內、外源因子污染的細胞基質是不適合用于生產的。但也存在例外，例如CHO和其他攜帶內源逆轉錄病毒的嚙齒類細胞株，已廣泛用于重組DNA技術產品的生產。在這種情況下，應納入風險降低與控制的策略，如在工藝中采用物理、化學或酶解等手段對其進行去除或滅活。應提供建立工作細胞庫的規程，每批WCB均應按規定進行一次全面的鑒別和純度測定，并制定包括分析方法、判定標準的在內的WCB質量標準，新建WCB也應符合該質量標準的要求。

1．1．4細胞基質遺傳穩定性應評估培養階段細胞基質的穩定性，檢測項目包括但不僅限于如:形態學特征，生長特征，生化標記，免疫標記，目的產物的表達量，或其他相關的基因型和核型標記。插入的核苷酸序列應至少在每一個主細胞庫培養期末進行一次確認。長期發酵的多次收獲物會導致一些質量屬性的飄移，例如糖基化等。出現的“新”的變體可能會影響產品的質量、安全和有效性。這類飄移的管理應該在工藝驗證研究中妥善地處理，明確宿主細胞在長時間培養后，表達產物分子的完整性，并且明確細胞基質的表型和基因型的特征，并綜合上述特征提出生產用細胞最高限定代次。

1．3生產過程控制

生物技術藥物的生產工藝基礎是采用活體表達系統進行目標產品的制備，主要包括細菌、酵母和哺乳動物細胞大規模培養技術等。建議應采用適當的方式、檢測頻率，證實細胞培養過程中無細菌、酵母和霉菌污染。由于某些生產細胞株可能或含有內源性逆轉錄病毒，因此應建立相應的工藝和可靠的分析技術，證明在培養過程中有效的將所有病毒清除或滅活。對目標產品質量屬性、生產工藝的深入理解和全面的設計，是建立可重復的、可控的工藝，保證穩定地生產出符合原液和成品質量標準的策略的一部分。因此，生產工藝可接受標準的限度，應根據從研發早期到規模化生產的整個工藝生命周期范疇中所獲得信息進行調整。在原液和成品的生產中，需在關鍵決策步驟(criticaldecisionmakingsteps)實施工藝過程控制，其他工藝環節的支持數據可確保工藝的一致性。對那些影響原液質量的工藝參數應制定可接受標準進行控制。適當的工藝過程控制能夠減少對原液和/或成品常規檢測的需求。

1．3．1細胞培養在生產過程中使用的每種材料(如:溶劑，試劑，酶)都應進行鑒定。應提供對這些原材料來源、質量和控制的資料。應適當提供證明這些原材料(包括生物來源的原料，如:培養基組成物，單克隆抗體，酶)符合既定用途質量標準(包括外來試劑的清除和控制)及物料供應商變更情況的資料。(1)有限傳代水平的生產應限定生產過程中的傳代或群體倍增的最高傳代次數(將從細胞凍融到生產結束的最大允許天數定義為細胞壽命的限度是可接受的)。應提供生產過程中培養、增殖和表達量一致性的數據。確立終止培養、廢棄培養物以及摒棄收獲物的標準。應提供經過長時間的培養后宿主細胞的表型、基因型特性以及所表達基因的分子完整性、一致性信息。證明上述特征的試驗所涉及的傳代范圍應超過規定的細胞最高限定代次。還應建立生產末期宿主細胞/載體的一致性監測手段，如質粒拷貝數及其在宿主細胞內的狀態等。(2)連續培養生產除上述要求外，細胞連續培養生產應根據系統穩定性和培養期間產品一致性的信息，明確連續培養的最長周期，并進行培養周期全過程的監測，監測類型及頻率取決于產品和生產系統特點。應提供生產中產品變異體或其它培養參數未超過標準限度的數據。建立適合于收獲階段的微生物污染常規檢測，明確收獲物后續加工中對“批次”的定義。根據宿主載體系統的穩定性和產品特性等確定對細胞、產品進行再評估的時間間隔。常規生產過程中，無論采用上述哪種培養方法，還均應符合現行版《中華人民共和國藥典》“生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及檢定規程”的有關規定。

1．3．2純化(提取回收和純化extraction，recovery＆purificaiton)從發酵液或細胞培養液中提取、純化蛋白主要依賴于各種蛋白分離技術。細胞培養或者酵母等真核發酵的優點是其蛋白產物大多都會分泌到培養液中，因此只要去除細胞或酵母就可以初步獲得較高純度的目的蛋白;而對于大腸桿菌等原核生產系統，常需要裂解細菌才能獲得目的蛋白。分離純化中，來自宿主細胞破碎后的微量蛋白酶會破壞蛋白的穩定性，且很難被去除，因此快速純化目的蛋白十分重要。在采用各種分離純化方法及任何新技術中，須保證分離純化手段的穩定，如確保層析柱的柱效等性能一致。并對純化工藝中可能殘存的有害物質進行嚴格檢測，這些組分包括但不僅限于固定相或者流動相中的化學試劑、各類親和層析柱的脫落抗體或配基、以及可能對目標產品關鍵質量屬性造成影響的各種物質。同時生物技術來源產品含有一些特定雜質，包括病毒、支原體等外源因子、核酸、宿主蛋白、內毒素以及源自培養液的各種其它殘余物質，因此需特殊的工藝將其去除或降低至可接受的水平。殘留細胞DNA(rcDNA):生產工藝的優化應考慮到對殘留宿主DN斷的大小、殘留量和生物活性的影響。采用適宜的方式將rcDNA總量降至可接受的水平，并就降低rcDN段的大小、或者滅活其生物活性的方式進行說明。通常產品中rcDNA水平應處于小于10ng/劑量至10pg/劑量的范疇。病毒清除:對于人和動物源的細胞基質，病毒去除或滅活工藝均應充分顯示能去除/滅活任何污染病毒、確保原液的安全性。該工藝應在小規模研究中驗證，并仔細選擇所用指示病毒，以評估所選擇生產工藝整體去除/滅活病毒的能力，并確定病毒載量下降程度明顯達到安全性邊界。

1．4生產工藝變更

在重組DNA產品的生命周期中(lifecycle)，通常因工藝改進、規模擴大、場地變換、穩定性改進、或遵循法規要求的變化而進行相應的變更。當生產工藝發生重大變更的時候，應對變更前后生產工藝對重組DNA產品質量、安全性和有效性的影響進行比較和評估。這些可比性研究雖不意味著變更前后質量屬性必須完全相同，但須證明它們的高度相似，并且現有知識能充分預測并確保任何質量屬性方面的差異對安全性和有效性無負面影響。并應解釋重大變更的原因，評估變更對質量、安全和有效性的潛在影響。

2質量控制

生物技術產品的質量控制與產品大小、結構特征、質量屬性復雜程度和生產工藝相關。其質量控制體系主要包括:原輔料檢驗和放行、生產和過程控制及文件、無菌工藝、常規放行檢定等。應通過終產品檢測、過程控制和工藝驗證結合的方法，確保各類雜質已去除或降低至可接受水平。生物技術產品質量控制的基本原則同樣包括使用參照物質、用經驗證的方法來評估已知和/或潛在產品、工藝相關物質。其和傳統藥物質控最主要差異是用于產品鑒別，一致性，純度和雜質檢測的分析方法不同。

2．1表征分析在研發階段以物理、化學和生物學方法對重組DNA產品的理化特性、生物學活性、免疫學特性、純度和雜質等進行嚴格的表征分析鑒定是至關重要的，并有助于質量標準的確立。對產品各種屬性進行充分鑒定分析的初衷，是為了確保產品安全有效。因此需采用廣泛的分析技術來展示目標分子不同的理化性質(分子大小、電荷、等電點、氨基酸組成、疏水性等)。對糖基化等各種翻譯后修飾也應充分鑒定，并納入適當的檢測以確認產品具有預期的構象、聚集和/或降解狀態及其高級結構。并應在適合的時候或條件下，將各類新型分析技術應用于表征分析。

2．1．1理化特性(1)一級結構一級結構，即包括二硫鍵連接方式的氨基酸序列。應盡可能使用綜合的方法測定目標產品的氨基酸序列，然后與其基因序列推斷的理論氨基酸序列進行比較。應注意可能存在的N末端甲硫氨酸(如:大腸桿菌來源的產品)，信號或者前導序列和另外可能的N、C末端修飾(如:乙酰化，酰胺化或者由于外肽酶導致的部分降解)，以及各種因N端和C端氨基酸序列變化導致的末端異質性(如:C端加工、N端焦谷氨酸、脫酰胺化，氧化，異構化，碎片化，二硫鍵錯配，N-連接和O-連接的寡糖，糖基化，聚集)。同時還應確定游離巰基和二硫鍵，并就二硫鍵的完整性和正確性進行分析。(2)糖基化修飾應對糖基化修飾進行全面的分析和確定，如糖基化修飾與清除和生物學活性相關，則應確定糖的含量(中性糖，氨基糖和唾液酸)。另外，應盡可能對糖鏈的結構、糖型(觸角、多糖本身的信息及特定位點的多糖分析)以及多肽鏈的糖基化位點進行深入分析。應特別注意的是，糖型結構可能與不良反應相關(如非人類的糖型結構或其殘基)，必要時應進一步就電荷異質性進行檢測分析。(3)高級結構應通過適合的物理化學方法表征高級結構并且通過生物學功能來確認。除生物學活性對高級結構的確證以外，體外或體內證實其治療功能(functionalactivityofthetherapeutic)的活性分析方法，也可作為高級結構確證的補充。聚乙二醇修飾蛋白的分析不僅限于修飾的平均率，還應包括修飾位點及占據位點的分析。

2．1．2生物學活性生物學活性是指產品能實現確定的生物學效應的特定能力或潛力。生物學活性應通過體外、體內、生物化學(包括:免疫化學試驗)的方法和/或適合的物理化學分析方法評估。效價測定(如:以單位、或國際單位表示)是與產品生物學特性相關屬性為基礎的生物學活性定量分析，而含量(以質量/重量表示)是物理化學方法測定的產品含量。對于效價的評價和賦值，在臨床情況下，采用反映產品生物學活性的生物測定是較好的方式，但在批放行中未必是可行或者必須的。例如:一些蛋白功能方面的生物學測定或者作用機制評價方法(并不是預期的臨床效果)也可作為效價分析和賦值的基礎。

2．1．3免疫化學特性需全面說明產品的相關免疫學特性。并應使用純化的抗原和抗原確定的區域進行結合實驗測定。如可能的話，應確定親合力和免疫反應性(包括與其它類似結構蛋白的交叉反應性)。對目標分子中，與相應表位作用的部分應盡可能的表征確證，如應包括這些結構的生物化學鑒別(如;蛋白質，低聚糖，糖蛋白，糖脂)和相關適合的特征研究(氨基酸序列，糖型)。由于糖基化和聚乙二醇化可能對產品的藥理學性質產生影響，并可能影響其免疫原性，因此應進行適當的表征研究。

2．1．4純度、雜質和污染物生物技術產品異質性的幾個來源(如:C-端加工，N-端焦谷氨酸化，脫酰氨化，氧化，異構化，片段化，二硫鍵錯配，N-連接和O-連接的寡糖，糖基化，聚集)通常造成其組成中存在幾種分子或變異體，導致了其純度/雜質情況的復雜性，因此需要通過綜合的方法來評估，對于產品相關物質和雜質應建立個體的和/或總體的可接受標準。雜質可能與生產工藝或與產品本身相關。如可能，這些雜質應盡可能地被分析鑒定，并采用適宜的方法評價其對生物學活性的影響。同時應恰當地鑒別、評估潛在的工藝相關雜質(如:宿主細胞蛋白，宿主細胞DNA，細胞培養殘留物，下游工藝的殘留物)，并對其定性和/或定量分析。污染物，包括所有引入且并非生產過程所需的物質(如:各種微生物，內毒素)。應嚴格避免引入污染物/或對其進行相應控制。還應考慮采用其他檢測方法，對可能的包括肽聚糖等在內的“非內毒素促炎性污染物”進行控制。(1)工藝相關的雜質和污染物工藝相關的雜質來源于生產工藝本身，主要包括細胞基質來源、細胞培養來源和下游工藝來源這三類。過程相關的雜質，并且可以分為三個主要類別:細胞物質衍生，細胞培養衍生和下游衍生。另一方面，例如外源病毒等污染物，因意外引入至生產工藝，并且是對生產工藝無用的材料。(2)產品相關物質和包括降解產物的雜質為了確定各種類型的修飾，可能需要付出相當大的努力對目標產品的各種分子變異體進行分離、鑒別和分析。當這些變異體的活性與目標產品一致時(comparable，一致性?)，這些變異體應被包括在產品的純度中。但應適當考慮在生產和/或儲存期間產品降解產物是否顯著增加。3．1．5含量應采用適宜的物理化學和/或免疫化學方法進行含量測定。以適宜的參考品為對照，蛋白含量(以質量/重量表示)可通過合適的方法進行測定(如:HPLC)。蛋白含量也能通過一個絕對定量的方法測定，例如:采用280nm處的消光系數，并以紫外分光光度法測定。建議采用第二種絕對定量的含量測定方法進行溯源和驗證，如果偏差太大，應考慮采用其他方法重新測定。

2．2常規放行質量控制在原液和成品的日常放行檢定中，并不需要進行所有的表征分析檢測。其中一些檢測可能僅需在最初和/或定期進行，以建立或驗證產品在生產過程的有效性或可接受性，如對生產初期的批次進行全面深入的表征分析，以確認在鑒別、純度和效價等方面的一致性。而另一些檢測要求在常規質量控制中進行。應對某一特定質量屬性是否放入常規放行標準予以說明。應對一定數量的連續批次進行分析，以確定分析參數的一致性。任何批間的差異均應得到關注。應根據這些研究中得到的數據，綜合臨床和非臨床研究，以及穩定性評價中收集的數據作為建立產品質量標準的基礎。質量標準是一系列包括各種分析方法、及含有具體數值限度、范圍可接受標準的綜合描述。其目的是為了使原液、成品或原料在其生產的各階段符合其預期用途所建立的一系列標準。“符合質量標準”意味著當按照列出的分析程序檢測原液和成品時，其質量符合可接受標準。質量標準的可接受范圍應依據研發過程收集的數據，包括從非臨床、臨床和穩定性研究得到的數據。可接受標準的范圍確定應該考慮到所使用的分析方法的靈敏度。

2．1．1鑒別鑒別實驗應高度特異，并應基于分子結構和/或其他專有屬性的獨特之處進行分析(如:肽圖，抗獨特型免疫或其他適宜的方法)。根據不同產品，其鑒別試驗可能需要不止一種檢測(物理化學的、生物和/或免疫化學)，這些檢測應具備充分的特異性，以區分在同一生產設施下生產的其它產品。

2．1．2純度和雜質需采用類似正交組合的方法來評估重組DNA產品純度/雜質的復雜的情況，并為產品相關的變異體建立單獨和/或總體的可接受標準。此外如適用，這些控制可進一步的確保產品的一致性。質量控制計劃中包括的對工藝相關雜質的質量控制(如:蛋白A、宿主細胞蛋白、DNA、其他潛在的培養或純化殘留物)是原液質量標準的典型組成部分。在一些情況下，如經充分證明，工藝相關雜質的質量控制可在恰當工藝步驟中的中間產品進行。如經充分驗證，生產工藝對工藝相關雜質的去除已達到高水平時，則這些工藝相關雜質的測定并非必須列入常規放行標準。

2．1．3效價效價測定是以產品生物學特性相關屬性為基礎的生物學活性定量分析，并且只要有可能，效價測定應反映或模擬其作用機制。比活性(每毫克產品具有的生物學活性單位)對證明產品的一致性具有重要的價值。只要有可能，原液和最終制劑的每個批次的效價應該使用適宜的國家或國際參比品，這個參比品的單位生物活性(比活性)通常已經過校準，例如國際單位(IU)。如果沒有這樣的參比品，經批準的內控參比品也可以用于方法的標準化(saystandardization)。

2．1．4含量采用適宜方法和參考品作為對照，測定原液和成品的含量3．1．5常規檢測應該根據相關產品的個論視情況而定。檢測可以包括外觀(例如，形狀、顏色)、溶解度、pH值、摩爾滲透壓、裝量、無菌、細菌內毒素、穩定劑和水分、可見和亞－可見微粒。

2．3包裝及密閉容器系統原液和成品密閉容器系統的描述應包括容器組成成份的說明。如果蛋白質和制劑輔料和/或容器包裝系統發生物理化學作用，可能導致潛在的免疫原性復合物形成。應評估但不僅限于容器吸附、產品和包裝材料之間的浸出、容器完整性、產品免于污染及保持無菌的適用性，并描述預期用途。

3標簽、儲存和運輸

除按中國藥典對藥品標簽規定的內容外，標簽還應標示下列內容:(1)每毫升的國際單位數(如必要);(2)每瓶容器的單抗含量或蛋白含量;(3)每瓶容器中液體樣品的體積;(4)凍干粉中;(5)所加復溶液體的名稱及體積;(6)復溶后的使用期限，確保該期限內各項檢測均應符合規定的標準;(7)使用之前進行適量稀釋(如果需要)。運輸條件應能確保產品保持在適合的環境條件下。

4討論及展望

篇10

【關鍵詞】 胃腫瘤 胃癌 生物學特性 病理學分型 化學療法 生存期

胃癌的腹膜種植轉移是胃癌根治術后復發的主要原因［1］，而胃癌的淋巴轉移對胃癌的預后有一定的影響。作者對289例胃癌淋巴結轉移情況和漿膜脫落細胞進行研究，擴大手術范圍，采用術前、術中化療，以探討胃癌生物學特性與預后的關系，為預防術后復發、轉移，延長生存期，提高生存質量提供理論依據。

1 資料和方法

1．1 一般資料 1990年—1999年我院共施行進展期胃癌手術289例，男210例，女79例。年齡40～77歲，平均65歲。

1．2 方法 胃癌手術開腹后探查前用100～150 ml生理鹽水倒入腹腔上部或盆腔，輕輕攪動后收集沖洗液，離心沉淀，吸取有核細胞層涂片4～6張，以瑞氏法和蘇木精－伊紅染色鏡下觀察有無脫落細胞，并對沖洗液的有核細胞層懸液進行了臺盼藍染色觀察。

1.3 病理學分型及分組 根據病理學分型，分為高分化腺癌組（n＝135）、中分化腺癌組（n＝83），低分化腺癌組（n＝51）和其他病理類型組（n＝20），回顧性分析術后3年和5年生存率、復發及死亡原因。

1.4 術式及化療方案 根據腫瘤分期、部位、類型選擇D2、D3、D4式手術。化療方案：術前選用FAM方案，術中溫生理鹽水420 ml+5-Fu 500 mg腹腔灌注沖洗。

1.5 統計學處理 用SPSS 12.0統計軟件進行統計學分析，采用行×列表χ2檢驗，P

2 結 果

2.1 不同分化程度胃腺癌患者不同術式及化療方案3年生存率的比較 見表1。

2.2 不同分化程度胃腺癌患者不同術式及化療方案5年生存率的比較 見表2。表1 3種分化胃腺癌患者不同術式及化療方案3年生存率的比較表2 3種分化胃腺癌患者不同術式及化療方案5年生存率的比較組內與D2清除及D3、D4清除比較：P＜0.05

2.3 其他病理類型組生存情況 其他3種類型胃癌病例較少，其中印戒細胞癌9例，黏液細胞癌7例，其他類型癌4例（包括未分化癌、不能分類的癌等）。這20例患者亦采用了以上幾種手術方式，經統計，無論采用何種術式及術前、術中是否化療，生存期均未超過1年。

2.4 不同分化胃腺癌患者淋巴結轉移率、沖洗液脫落細胞學陽性率、網膜種植轉移率情況 見表3。表3 不同病理分型患者淋巴結轉移率、沖洗液脫落細胞陽性率和網膜種植轉移率情況

2.5 胃癌死亡原因 本組死亡病例共84例，其中腹腔廣泛種植轉移52例，肝轉移22例，其他原因10例。

3 討 論

胃癌的發病率及死亡率始終居消化系統惡性腫瘤之前列。當今胃癌的淋巴結清除范圍，應根據患者的胃癌病期和癌腫的生物學特性加以區別對待。在此原則下，應充分考慮到患者的諸多個體特點，優選出合理的手術方案。對胃癌應根據不同病理類型和不同的病期選擇合理的治療方案，術前對于病理類型的判斷尤為重要。很多研究表明新輔助化療可以提高進展期胃癌的手術切除率及改善預后，因而廣受重視。本組結果顯示，早期及高分化癌的手術根治率較高，行新輔助化療的意義不大，中晚期及高惡度胃癌則明顯可以看出其作用，故術前對患者進行腫瘤分期和明確病理類型極為重要。

許多文獻表明新輔助化療可以提高進展期胃癌的手術切除率及預后，因而廣受重視。早、中期胃癌手術切除治療率高，行新輔助化療的意義不大。腫瘤腹腔廣泛播散或遠處轉移者預后太差，也不應納入其范疇內。所以準確的術前術中分期對病例的術式選擇至關重要［2］。從本組可以看出，腫瘤細胞分化程度越低，淋巴結轉移越多，腹膜種植轉移概率越高，說明其浸潤廣泛，對術后5年生存率有明顯的影響。胃癌新輔助化療有幾個優勢：①可以殺滅術區以外的亞臨床轉移灶，預防醫源性腫瘤播散。②殺滅癌細胞，降低臨床分期，增加手術切除率或根治性切除的機會。③獲得腫瘤的個體藥敏資料，為術后選擇輔助化療提供依據。④腫瘤對化療的效果是判斷患者預后的指標之一。

腹膜種植轉移是胃癌患者術后最常見的復發形式，由于其早期診斷有一定困難，目前腹膜種植轉移復發患者尚無有效的治療方法［3］。從死因可以看出，患者術后復發主要為腹膜種植轉移，術中預防醫源性癌細胞脫落尤為重要。術中應注意無瘤操作技術，不用紗布擦拭手術野外的臟器，盡量減少暴露、擦拭、損傷腹膜，以免增加癌細胞的黏附因素；盡量防止血液流入腹腔，去除白細胞、血小板高黏附癌細胞的因素；同時腹腔灌注化療必不可少，優點是腹腔內藥物濃度高，可有效殺滅脫落的癌細胞。術前或術中證實有腹膜轉移患者，除術中化療以外，應于術后輔以腹腔灌注化療及全身化療，可望減少術后腹膜種植復發率。

手術范圍的選擇也極為重要。一些學者認為擴大胃周圍淋巴結清除能夠提高患者術后5年生存率，并且淋巴結清除及病理學檢測對術后的正確分期判斷預后、指導術后監測和選擇術后治療方案都有重要的價值［4］。D3術式在高分化癌中，并不比D2能提高生存率，反而增加了手術風險，而對于低度分化癌中，D3術式則是明顯提高了5年的生存率，故根據病理切片類型選擇術式，對于胃癌的預后也有明顯的影響。從本組結果可以看出：高中分化腺癌行D2術式已能完成患者的治療，而D3術式并不比D2術式生存率高，術前化療及術中的腹腔化療并不能提高生存率，反而增加了患者的創傷。低度分化癌單純的擴大手術范圍及單純的腹腔沖洗、單純的術前化療，均能延長患者的生存期，而且聯合應用時更明顯地增加了療效。 印戒細胞癌、黏液細胞癌等極高惡度胃癌，無論采取何種術式或是否采用術前術中化療，均不能明顯延長生存期。我們的研究結果表明，胃癌治療應根據其生物學特性及病理學分型，采用合適的手術范圍及術前術中化療等措施，可明顯延長生存期，改善生存質量。

總之，在胃癌治療過程中，應重視其生物學特性對預后的影響，結合病理診斷及其分期，采取不同的術式，術前術中采用不同的預防措施，可明顯延長患者的生存期及改善生存質量。胃癌的治療選擇及預后取決于多種因素，本文僅從病理類型方面作了初步探討，其他因素的影響還有待深入研究。

【參考文獻】

［1］ 張文范.影響胃癌根治切除術后長期生存因素的探討——附術后生存5年以上88例分析［J］.腫瘤防治研究，1982，9（1）：18-22.

［2］ Fink U， Stein HJ， Schuhmacher C， et al. Neoadjuvant chemotherapy for gastric cancer： update［J］. World J Surg，1995，19(4)：509-516.