工地保密制度范文

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篇1

【摘要】 目的: 探討氧化低密度脂蛋白(oxLDL)對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)可誘導(dǎo)共刺激分子配體(ICOSL)的影響。方法: 以人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象， 通過間接免疫熒光、 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)和Western blot等方法， 觀察ICOSL在人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及oxLDL的干預(yù)作用。結(jié)果: 對照組和oxLDL刺激組ICOSL mRNA的平均光密度OD值分別為0.071±0.035和0.186±0.044(n=6)， ICOSL Western blot吸光度A值分別為10.88±1.53和16.03±4.08(n=6)， oxLDL(100 mg/L)可增加ICOSL在人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)， 并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

【關(guān)鍵詞】 ICOSL; oxLDL; 冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞; 動脈粥樣硬化; 免疫

[Abstract] AIM: To study the expression of inducible costimulator ligand(ICOSL) on human coronary artery endothelial cells(HCAEC) and its being interferentialed by oxidized low density lipoprotein(oxLDL). METHODS: ICOSL expression levels were determined by the fluorescence， reverse transcription PCR (RTPCR) and Western blot， respectively. RESULTS: The ICOSL mRNA OD values of control and 100 mg/L oxLDL group was 0.071±0.035 and 0.186±0.044， respectively. The Western blot A values of control and 100 mg/L oxLDL group was 10.88±1.53 and 16.03±4.08， respectively. oxLDL increased expression of ICOSL mRNA and protein(P

[Keywords]inducible costimulator ligand; oxidized low density lipoprotein; human coronary artery endothelial cells; atherosclerosis; immune

動脈粥樣硬化(atherosclerosis， AS)作為一個慢性炎癥反應(yīng)的理論已被廣泛接受， 新近研究發(fā)現(xiàn)， 在AS發(fā)生發(fā)展的整個進(jìn)程中都有免疫反應(yīng)的參與， 通過免疫調(diào)節(jié)治療AS正在成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。可誘導(dǎo)共刺激分子配體(inducible costimulator ligand， ICOSL)是新近發(fā)現(xiàn)的B7家族成員， 主要在活化的B細(xì)胞、 肥大細(xì)胞、 部分活化的單核細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞、 腎小管上皮細(xì)胞和造血母細(xì)胞上表達(dá)， ICOSLICOS這一對共刺激信號在抗原呈遞和自身免疫性疾病中起重要作用， 并參與了AS的進(jìn)程[2]。冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(human coronary artery endothelial cells， HCAEC)既是內(nèi)分泌組織又是激素反應(yīng)組織， 與血管壁炎癥、 動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。氧化低密度脂蛋白(oxidationlow density lipoprotein， oxLDL)可分泌致AS的細(xì)胞因子和炎癥因子， 還是AS細(xì)胞免疫反應(yīng)中最主要的自身抗原[3]。本研究中以HCAEC為研究對象， 觀察公認(rèn)的具有致AS作用的oxLDL對ICOSL表達(dá)的影響， 為AS的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco， USA)， HCAECc12221細(xì)胞株(Science Cell公司)， 羊抗人ICOSL mAb(Santa Cruz Biotechnology公司)， oxLDL(北京協(xié)和三友科技有限公司)。ICOSL和GAPDH(作為內(nèi)參)引物由英俊公司設(shè)計(jì)合成， TRIgol試劑盒和RTPCR試劑盒分別為BilFlux和TaKaRa公司產(chǎn)品， 其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 復(fù)蘇HCAEC， 調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為3×109/L， 用含100 mL/L胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)， 接種于24孔培養(yǎng)板， 細(xì)胞長至70%～80%時換用無血清培養(yǎng)液24 h， 換液后即可用于實(shí)驗(yàn)。內(nèi)皮細(xì)胞鑒定采用Ⅷ因子相關(guān)抗原， 按SP免疫組化試劑盒說明書操作。倒置相差顯微鏡下細(xì)胞呈單層鵝卵石狀生長， 有接觸抑制現(xiàn)象。胞質(zhì)著色者為陽性細(xì)胞。細(xì)胞純度>99%， 臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于97%。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為2組， 空白對照組和100 mg/L oxLDL組。

1.2.3 間接免疫熒光檢測ICOSL的表達(dá) 制備HCAEC爬片， 固定液(含20 g/L多聚甲醛和1 mL/L TRIton X100)室溫固定30 min， PBS洗2次， 以1∶50 PBS(pH7.2)稀釋的正常羊血清封閉20 min， PBS洗3次， 每次1～2 min， 滴加0.1 mol/L PBS(pH 7.2)1∶100稀釋的ICOSL的羊單克隆抗體， 37℃孵育30 min， PBS洗5次， 每次2 min， 加入FITC標(biāo)記的兔抗羊二抗， 避光， 4℃下孵育30 min， PBS洗3次， 熒光顯微鏡下觀察， 攝影。

1.2.4 RTPCR檢測人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞ICOSL及GADPH看家基因的表達(dá) 以TRIzol試劑盒抽提HCAEC總RNA， DU530紫外分光光度儀(Beckman公司)測定樣本總RNA含量。采用一步法RTPCR試劑盒進(jìn)行ICOSL基因和GADPH看家基因表達(dá)檢測， 反應(yīng)體系和條件按試劑盒說明書進(jìn)行。用于ICOSL基因RTPCR的引物序列為: 5′AGGAAGTCAGAGCGATGGTAG3′(上游引物序列)， 5′AGGCTGTTGTCCGTCTTATTG3′(下游引物序列)， 目的片段469 bp。用于GADPH看家基因RTPCR的引物序列為: 5′CGACCA CTTTGTCAAGCTCA3′(上游引物序列)， 5′AGGGTCTACATGGCAACTG3′(下游引物序列)， 目的片段240 bp。反應(yīng)結(jié)束后， 取反應(yīng)產(chǎn)物10 μL進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳， 溴化乙錠染色， UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng)攝圖， 并分析各組目的基因及GAPDH基因平均光密度值(OD)， 以二者的比值代表ICOSL的表達(dá)。以PCR產(chǎn)物為模板， 用ICOSL特異引物作為測序引物置ABI 3730型測序儀進(jìn)行序列測定， 并將所得的測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性比較。ICOSL序列比較使用NCBI網(wǎng)站提供的BLAST程序。

1.2.5 Western blot檢測人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞ICOSL蛋白的表達(dá) 收獲細(xì)胞2×1010/L， PBS洗2次， 提取膜蛋白后， 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離， 將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上， 在PBST洗滌緩沖液中輕輕搖動， 洗滌15 min。加入一抗， 室溫孵育1 h， PBST洗膜3次。加入二抗， 孵育1 h， PBST洗膜3次。ECL液染色， 曝光， 化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)成像， 分析各組目的條帶及GAPDH的吸光度值(A)， 以二者的比值代表ICOSL蛋白表達(dá)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示， 兩因素比較采用析因方差分析， 組間差異比較采用oneway ANOVA， 多重比較采用LSD(least significant digit)法， 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。P

2 結(jié)果

2.1 ICOSL在人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá) 熒光顯微鏡下， 可見ICOSL表達(dá)于HCAEC表面， 呈綠色熒光。RTPCR結(jié)果顯示可見ICOSL的mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物片段位于相當(dāng)與Mr 469的位置， 與預(yù)期理論值大小一致(圖1A)， 產(chǎn)物特異， 條帶清晰， 經(jīng)測序與基因庫中人ICOSL基因序列完全吻合(結(jié)果略)。HCAEC表達(dá)ICOSL 蛋白水平， 通過Western blot顯示ICOSL的蛋白約為Mr 70 000， 與理論值基本一致(圖1B)。

2.2 oxLDL對HCAEC表達(dá)ICOSL mRNA和蛋白水平的影響 RTPCR及Western blot結(jié)果顯示: oxLDL刺激組ICOSL的平均光密度OD值和吸光度A值均分別高于對照組， oxLDL可增加ICOSL在HCAEC中的mRNA和蛋白表達(dá)， 并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

.3 討論

自20世紀(jì)80年代開始的一系列研究發(fā)現(xiàn)， 參與動脈粥樣斑塊形成過程的細(xì)胞和分子都是那些參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞和分子， 從而炎癥理論得到了完善[4]。隨著對AS研究的深入， 越來越多的證據(jù)顯示AS不但具有慢性炎癥的特征， 而且炎癥反應(yīng)的起始與持續(xù)都有先天性和獲得性免疫應(yīng)答的參與， 免疫介導(dǎo)在AS的發(fā)生機(jī)制和心血管觸發(fā)事件發(fā)生中起重要作用， 其中T細(xì)胞活化是核心環(huán)節(jié)[4]。業(yè)已證實(shí)， T細(xì)胞活化依賴雙重信號: 抗原刺激和共刺激信號， 且后者更為重要。ICOSL屬于B7家族的新成員， 為一個由309個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜糖蛋白， 大小約63 000～72 000， 它與可誘導(dǎo)共刺激分子(inducible costimulator， ICOS)的基因突變或表達(dá)異常與某些炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道， ICOSLICOS這一對配體受體參與了AS的發(fā)生和發(fā)展[2]。本研究應(yīng)用3種方法， 從定性到定量， 不僅在形態(tài)上(熒光顯微鏡下)， 而且在mRNA分子水平(RTPCR)和蛋白質(zhì)水平(Western blot)證實(shí)ICOSL表達(dá)在HCAEC的細(xì)胞膜上， 這為研究ICOSICOSL共刺激途徑與AS免疫病理過程的關(guān)系提供了直接依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。血中oxLDL濃度升高是AS發(fā)展的獨(dú)立的危險(xiǎn)因素， oxLDL是炎癥反應(yīng)的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑， 在破裂的斑塊脂質(zhì)核心中非常豐富。體外試驗(yàn)表明， oxLDL可損傷內(nèi)皮細(xì)胞表面層糖萼， 導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力增強(qiáng)， 使血液中的單核細(xì)胞易于黏附于EC表面， 也可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞表達(dá)黏附分子、 趨化性細(xì)胞因子、 促炎因子及其他炎癥反應(yīng)的中介物。近年來許多資料提示， oxLDL也是動脈粥樣硬化細(xì)胞免疫反應(yīng)中最重要的抗原， 經(jīng)巨噬細(xì)胞表面的清道夫受體A、 CD36、 SRB1、 LOX1、 SRPSOX等途徑吞噬降解的oxLDL片段被巨噬細(xì)胞以抗原肽MHC分子復(fù)合物方式呈遞給鄰近的T細(xì)胞和B細(xì)胞， 導(dǎo)致T、 B細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌、 細(xì)胞毒性作用、 抗體產(chǎn)生等一系列特異性免疫反應(yīng)[5]。此外， 抗oxLDL抗體存在于人體和實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化斑塊中， 說明oxLDL還能夠誘發(fā)體液免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中加入oxLDL刺激后， 分別運(yùn)用RTPCR和Western blot檢測ICOSL的表達(dá)量的變化， 結(jié)果顯示ICOSL的mRNA平均光密度值和蛋白吸光度值比空白對照組明顯增加， 文獻(xiàn)報(bào)道oxLDL可使單核細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CD40及CD40L的表達(dá)上調(diào)[6]， 本研究的結(jié)果表明oxLDL能明顯促進(jìn)HCAEC表達(dá)ICOSL， 因此很可能是oxLDL致AS發(fā)生發(fā)展的又一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

總之， oxLDL及ICOSL參與了AS的免疫反應(yīng)， 提示AS免疫機(jī)制可能通過B7家族共刺激分子實(shí)現(xiàn)， ICOSL能否作為反映AS炎癥反應(yīng)程度及AS病變活動的重要指標(biāo)， 還需進(jìn)一步研究。

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